Technologia małych cząstek – liposomy, mikrocząstki, mikrokapsułki, mikrosfery, nanocząstki lipidowe.

W obecnym artykule będzie skupiona uwaga na technologii otrzymywania małych cząstek jak liposomy, mikrocząstki, które mogą być często mylone pod względem ich wielkości, budowy czy sposobu otrzymywania, a nawet zastosowania. Właśnie te aspekty technologiczne pojawiały się na teoretycznej części egzaminu specjalizacyjnego.

Liposomy

Liposomy to struktury o kształcie kulistym, których ściany tworzą dwuwarstwowe błony stanowiące otoczkę, wewnątrz których znajduje się faza wodna. Błony tworzące ścianę liposomu są zbudowane z amfifilowych lipidów, uporządkowanych w postaci podwójnej warstwy lipidowej (bilaminarnej). Hydrofilowe komponenty lipidów warstwy podwójnej są skierowane w stronę fazy wodnej, lipofilowe komponenty obu warstw lipidowych są skierowane do siebie, tworząc wewnętrzną warstwę hydrofobową tej błony. W skład otoczki wchodzą głównie fosfolipidy, a także cholesterol i glikolipidy.

Glikolipidy są zbudowane z reszt sacharydowych połączonych kowalencyjnie z lipidami i są składnikiem błon komórkowych. Fosfolipidy to związki będące składnikami błony komórkowej, należące do lipidów, które są estrami glicerolu, kwasów tłuszczowych, kwasu fosforowego oraz związków azotowych: seryny, etanolaminy lub choliny. Otoczka fosfolipidowa może być obojętna, może mieć na powierzchni ładunek dodatni (przez dodatek stearyloaminy, bromku cetylotrimetyloamoniowego) lub ujemny (przez dodatek kwasu fosfatydowego lub diacetylofosforanu).

Liposomy mogą być zbudowane z pojedynczej otoczki (jednowarstwowe) lub z kilku błon fosfolipidowych układających się koncentrycznie na przemian z warstwami wody (wielowarstwowe). Mogą być stosowane jako nośniki substancji leczniczych lub też służyć jako modelowe błony komórkowe. Substancje lecznicze rozpuszczalne w wodzie są umiejscowione w warstwie wodnej liposomu, a substancje hydrofobowe w części lipidowej fosfolipidu.

Liposomy można podzielić na:

małe liposomy jednowarstwowe – SUV (small unilamellar vesicles);
duże liposomy jednowarstwowe – LUV (large unilamellar vesicles);
duże liposomy wielowarstwowe – MLV (multilamellar large vesicles);
oligoliposomy wielowarstwowe – OLV (oligolamellar large vesicles);
liposomy multipęcherzykowe – MVV (multivesicular vesicles).

SUV mają średnicę od 20-50 nm. Objętość podwójnej warstwy lipidowej jest w nich około 5 razy większa niż wewnętrznej przestrzeni wodnej, dlatego stosowane są głównie jako modelowa błona komórkowa. Z powodu małej objętości wewnętrznej fazy wodnej mogą inkorporować tylko niewielką ilość substancji hydrofilowych.

LUV mają średnicę powyżej 50 nm. Wykazują większą trwałość podczas przechowywania, bo nie występują duże naprężenia w podwójnej warstwie lipidowej ze względu na ich większy rozmiar. Mogą być stosowane jako model błony komórkowej oraz jako nośniki dla substancji leczniczych ze względu na korzystną proporcję fazy wodnej do lipidowej. Błona lipidowa LUV jest bardzo podobna do błony komórkowej, stąd mogą być stosowane do pomiaru dyfuzji substancji leczniczych przez błony biologiczne, a także do badania podziału substancji leczniczych między lipidowe błony biologiczne a fazę wodną.

OLV powstają jako produkty uboczne otrzymywania LUV. Posiadają wiele nakładających się podwójnych warstw lipidowych. Uwalnianie z nich substancji leczniczej może być opóźnione.

MLV mają średnicę 100-1000 nm. Powłoczka jest utworzona z wielu podwójnych warstw lipidowych, co może być wykorzystane do uzyskania opóźnionego uwalniania substancji leczniczych.

MVV powstają podczas otrzymywania MLV, a w związku z tym, MVV to liposomy, w których dwa lub więcej mniejszych liposomów jest otoczonych dodatkową wspólną podwójną błoną lipidową.

Zastosowanie liposomów wynika z możliwości zamknięcia w nich hydrofilowych substancji leczniczych w ich wewnętrznej fazie wodnej, zaadsorbowaniu na podwójnej błonie lipidowej substancji amfifilowych czy inkorporowaniu lipofilowych substancji do podwójnej warstwy lipidowej błony.

Liposomy mogą być stosowane w formie: depot (o kontrolowanym uwalnianiu) lub targeting (jako nośniki leków do określonych narządów). Mogą także być podawane pozajelitowo lub na skórę. Są mało odporne na odczyn soku żołądkowego, enzymy przewodu pokarmowego i kwasy żółciowe w jelicie cienkim, dlatego nie można stosować ich doustnie. Nie wprowadza się ich także podskórnie lub domięśniowo, bo pozostają one w miejscu podania, co może prowadzić do uszkodzenia tkanek.

Z substancji leczniczych w postaci liposomów podaje się dożylnie daunorubicynę, doksorubicynę, amfoterycynę B, cytarabinę. Do stosowania zewnętrznego na skórę podawane są liposomy zawierające ekonazol i heparynę. Liposomy są też stosowane jako nośniki środków kontrastujących, wykorzystywanych w diagnostyce rentgenowskiej lub rezonansu jądrowego.

Liposomy do podawania pozajelitowego powinny być jałowe i apirogenne oraz izotoniczne i izohydryczne. Wielkość liposomów do celów pozajelitowych powinna wynosić poniżej 0,2 µm. Wybór lipidu powinien być tak dobrany, aby zapobiec zwiększeniu ich wielkości podczas przechowywania.

Po podaniu dożylnym zawiesina liposomów ulega destabilizacji z powodu wymiany tłuszczowej fosfolipidów pod wpływem lipoprotein osoczowych, przede wszystkim przez frakcję HLD. Z tego powodu stosuje się dodatek cholesterolu do preparatu, co zapobiega wymianie lipidów i ma korzystne działanie stabilizujące. Wadą stosowania pozajelitowego liposomów jest ich natychmiastowy wychwyt przez komórki fagocytarne układu siateczkowo-śródbłonkowego (RES). Po dożylnym podaniu liposomów już po kilku minutach znaczna ich część znajduje się w układzie siateczkowo-nabłonkowym w wątrobie i śledzionie. Jest to spowodowane adsorpcją na powierzchni liposomów białek osoczowych (opsonin), a następnie ich wychwytem przez makrofagi tkankowe. Komórki te rozpoznają liposomy na podstawie swoistości opsonin i eliminują je jako ciała obce.

W celu zapobiegania adsorpcji liposomów przez RES powierzchnię liposomów pokrywa się hydrofilowymi polimerami, np. polietylenoglikolem, PEG o masie cząsteczkowej ok. 2000. PEG wiąże się kowalencyjnie jednym końcem cząsteczki na ok. 10% powierzchni lipidów i zapobiega adsorpcji białek. Tak zmodyfikowane liposomy określa się jako preparaty o przedłużonym krążeniu, RES-odporne. Charakteryzują się one biologicznym okresem półtrwania w krwiobiegu do 20 godzin.

Podanie celowane (targeting) liposomów do określonych tkanek stwarza ograniczone możliwości ich stosowania, bo lipofilowe substancje lecznicze, które rozpuszczają się w powłoczkach liposomów nie są w sposób trwały związane i ulegają szybkiemu podziałowi do otaczających komponentów lipofilowych, np. albumin osoczowych lub błon komórkowych.

Po podaniu na skórę liposomy dzięki działaniu okluzyjnemu mogą zwiększyć hydratację zrogowaciałego naskórka i przez to wpływają na zwiększenie penetracji substancji lipofilowych, ale nie przedostają się do krążenia ogólnego. Liposomy nie przechodzą przez skórę i dlatego nie mogą pełnić funkcji hydrofilowych nośników dla substancji leczniczych. Liposomy znacznie różnią się od składu lipidowego skóry, stąd przy dłuższym stosowaniu mogą zakłócić funkcję ochronną skóry.

Otrzymywanie liposomów

Do sporządzania liposomów są stosowane lipidy naturalne, syntetyczne i półsyntetyczne. Wykorzystywane są fosfolipidy pochodzące z żółtka jaja kurzego lub z soi. Są to mieszaniny fosfolipidów o kwasach tłuszczowych powyżej 16 atomów węgla, różnej długości i o różnym stopniu nasycenia. Mają dobrą jakość, jeśli nie występują dodatkowo lizolipidy i składniki niefosfolipidowe i inne składniki takie jak: fosfatydyloetanoloamina i sfingomielina. Fosfolipidy z jaj i soi tworzą w temperaturze 0°C i powyżej temperatury ciała płynno-krystaliczne filmy. Płynność i związaną z tym przepuszczalność filmu można zmniejszyć przez dodatek cholesterolu lub stosowanie fosfolipidów z nasyconymi kwasami tłuszczowymi. Fosfolipidy z nasyconymi kwasami tłuszczowymi otrzymuje się na drodze redukcji katalitycznej fosfatydylocholin z jaj i soi.

Liposomy można otrzymać w wyniku:
A. procesu spontanicznego;
B. procesu mechanicznego;
C. z zastosowaniem rozpuszczalników organicznych;
D. z zastosowaniem detergentów;
E. z modyfikacją powierzchni.

A. Proces spontaniczny
Po dodaniu wody do suchych filmów lipidowych ulegają one hydratacji, a następnie pęcznieniu. Pod wpływem wody tworzą się spontanicznie MLV wielowarstwowe, OLV oligoliposomy oraz o strukturze mieszanej, które pod wpływem niewielkiego mechanicznego oddziaływania, np. wytrząsania przeobrażają się w liposomy.

B. Procesy mechaniczne
Do tych procesów zalicza się metody, dzięki którym wielowarstwowe MLV są rozrywane z wytworzeniem liposomów o innej budowie, przy zastosowaniu siły ścinania, ciśnienia lub ultradźwięków. Zmniejszenie powstających MLV można uzyskać za pomocą aparatu do homogenizacji. Przez zastosowanie ultradźwięków o dużej energii, z użyciem głowic ultradźwiękowych, tworzą się SUV, co można stwierdzić już po około 10 minutach na podstawie klarowania się zawiesiny lipidowej. Zastosowanie łaźni ultradźwiękowej pozwala jedynie na otrzymanie mniejszych MLV.

Przy zastosowaniu innych aparatów takich jak homogenizator szczelinowy, aparat do otrzymywania mikroemulsji czy homogenizator wysokociśnieniowy, tworzą się większe MLV i LUV.

Wykazano, że nakład zastosowanej energii ma istotny wpływ na wielkość przyrządzanych liposomów, na przykład pod wpływem ciśnienia ok. 700 barów i w 5-krotnym cyklu homogenizacyjnym uzyskuje się liposomy o średnicy około 40 nm. Pod wpływem wyższego ciśnienia powstają najpierw mniejsze liposomy, które z powodu napięcia ich błony, w krótkim czasie mogą ulec fuzji z wytworzeniem niehomogennej mieszaniny LUV i OLV. Zastosowanie ekstruzji, czyli przetłaczania zawiesiny liposomów przez błony poliwęglanowe o określonej wielkości porów umożliwia otrzymywanie mieszaniny liposomów LUV i OLV.

C. Zastosowanie rozpuszczalników organicznych
Filmy lipidowe, po rozpuszczeniu w rozpuszczalnikach organicznych, a następnie wprowadzeniu ich do roztworów buforowych, tworzą liposomy, których mechanizm powstawania zależy od mieszania się tego rozpuszczalnika z wodą (roztwory alkoholowe czy eterowe). Jeżeli stosuje do tego celu roztwory alkoholowe – to powstają głównie liposomy SUV, a gdy roztwory eterowe – powstają LUV i OLV.

D. Zastosowanie detergentów
Do otrzymywania liposomów nadają się detergenty, które przy stężeniach powyżej ich krytycznego stężenia micelarnego (CMC) tworzą z lipidami płytkowate agregaty. Związane z micelami mieszanymi detergenty pozostają w równowadze z ich wolną formą cząsteczkową w roztworze dyspergującym.

Jeżeli w roztworze zostanie zmniejszone stężenie wolnych cząsteczek detergentów, ustala się nowy układ równowagi w wyniku desorpcji detergentów z mieszanych miceli do roztworu dyspergującego. Prowadzi to do łączenia się miceli mieszanych. Usuwanie wolnej formy cząsteczkowej detergentów prowadzi do zwiększenia miceli laminarnych. Po przekroczeniu pewnej krytycznej wielkości tych miceli wytwarzają się w nich napięcia, które zapoczątkowują ich zaokrąglanie — prowadzi to do procesu formowania się liposomów.

W procesie tym wielkości otrzymywanych liposomów są uzależnione od rodzaju detergentu, proporcji detergentu do stężenia początkowego użytych lipidów, szybkości usuwania detergentu z roztworu i temperatury prowadzenia procesu.

E. Modyfikacja powierzchni liposomów
Powierzchnię liposomów można zmodyfikować w celu ich swoistego rozpoznania przez docelowe tkanki, komórki. W celu „uwidocznienia” liposomów opracowano różne metody ich sprzęgania ze znacznikami za pomocą przeciwciał, enzymów lub innych cząsteczek.

Inkorporowanie substancji leczniczej do liposomów

Lipofilowe substancje lecznicze rozpuszcza się w rozpuszczalnikach organicznych razem z lipidami tworzącymi błonę. Po odparowaniu rozpuszczalnika i rozproszeniu pozostałości w roztworze buforowym, lipofilowa substancja lecznicza wbudowuje się do błony lipidowej liposomów.

Substancje hydrofilowe sprzęga się za pomocą wiązania kowalencyjnego z użyciem „pośredników” z błonami lipidowymi, wiążąc je z kwasami tłuszczowymi lub fosfolipidami i jako proleki wbudowuje je do błon lipidowych.

Substancje hydrofilowe można również inkorporować do wewnętrznej wodnej przestrzeni liposomów. Stosując mechaniczne metody produkcji, należy w uprzednio przyrządzonych liposomach przejściowo zwiększyć przepuszczalność ich błon. Można to osiągnąć za pomocą destabilizacji błony przez usunięcie jej powłoczki hydratacyjnej, co prowadzi do jej częściowego rozluźnienia, w wyniku czego znacznie się zwiększa przepuszczalność. Taką modyfikację błon lipidowych uzyskuje się przez liofilizację i rehydratację, bądź przez cykliczny proces zamrażania i rozmrażania, z ewentualnym dodatkowym oddziaływaniem ultradźwiękami.

Znaczne ilości niektórych substancji leczniczych można inkorporować, stosując gradient pH, który powoduje ich transport przez błony liposomów. Dobierając odpowiednie pH w wewnętrznej i zewnętrznej fazie zawiesiny liposomów można w nich zamykać słabe kwasy i zasady. Przez błony lipidowe liposomów dyfundują z zewnętrznej fazy ciągłej do wewnętrznej fazy wodnej liposomu niezjonizowane cząsteczki substancji leczniczych o właściwościach lipofilowych, gdzie pod wpływem innego pH ulegają ponownie jonizacji, przyjmując formę hydrofilową, pozostając w ich wnętrzu.

Inny sposób inkorporowania substancji leczniczej do gotowych liposomów polega na wywołaniu krótkotrwałej przepuszczalności ich błon przez dodatek minimalnych ilości substancji powierzchniowo czynnych.

Mikrocząstki

Przechodząc do kolejnej grupy małych cząstek stosowanych w technologii należy określić ich definicje. Termin mikrocząstki jest definiowany jako pojęcie wyższego rzędu w stosunku do mikrokapsułek i mikrosfer, odnoszące się do cząstek o średnicy od 1 do 1000 µm. Nanocząstki – są to w szerszym znaczeniu koloidalne układy ciał stałych zbudowane z substancji czynnej i polimeru o średnicy od 50 nm do 500 nm. Wyróżnia się nanokapsułki i nanosfery.

Mikrokapsułki

Mikrokapsułki są to kapsułki wielkości 5-1000 µm, zwykle 100-500 µm. Składają się z rdzenia i otoczki. Rdzeń może stanowić substancja stała, ciekła (roztwór, zawiesina, emulsja) lub gazowa. Masa rdzenia wynosi zwykle 30-95% masy mikrokapsułki. W zależności od rodzaju rdzenia mikrokapsułki mają kształt kulisty lub nieregularny. Otoczki tworzą związki naturalne lub syntetyczne, takie jak: żelatyna, guma arabska, szelak, kalafonia, octanoftalan celulozy, etyloceluloza, karboksymetyloceluloza, metyloceluloza, nitroceluloza, octan celulozy, polialkohol winylowy, poliamidy, glikol polioksyetylenowy, polipropylen, poliwinylopirolidon, a także mieszaniny polimerów.

Metody otrzymywania mikrokapsułek:
A. metoda koacerwacji: w środowisku wodnym lub bezwodnym;
B. metoda polimeryzacji międzyfazowej;
C. metoda topliwej dyspersji;
D. metoda z zastosowaniem obrotowego bębna;
E. metody powlekania w warstwie fluidalnej lub w bębnie drażerskim.

A. Metoda koacerwacji – wykorzystuje się tu zjawisko koacerwacji, czyli rozdzielania faz w roztworze koloidów lub polimerów z utworzeniem 2 lub więcej faz ciekłych. Koacerwację można przeprowadzić w środowisku wodnym i środowisku bezwodnym.

Koacerwacja w środowisku wodnym polega na tym, że w wodnym roztworze materiału otoczkującego (np. żelatyny) zawiesza się lub emulguje rdzenie, po czym pod wpływem jednego z czynników: zmiany temperatury, stężenia, pH, dodatku soli, następuje wydzielanie koloidu substancji wielkocząsteczkowej w postaci ciekłych kropelek, które osadzają się na rdzeniach, łączą się ze sobą i tworzą wokół nich ciekłą ściankę. Ścianki zestala się przez dalszą desolwatację tworzywa. Koacerwacja może również przebiegać w układzie złożonym z więcej niż jednej substancji koloidalnej, np. gumy arabskiej z żelatyną.

Koacerwacja w środowisku bezwodnym – polega na tym, że koacerwacja następuje pod wpływem dodatku płynu mieszającego się z roztworem polimeru, lecz nie będącego rozpuszczalnikiem dla rdzenia i polimeru. W przypadku polimeru rozpuszczającego się dobrze na gorąco koacerwację można zapoczątkować obniżając temperaturę układu. Podczas schładzania tworząca się otoczka stopniowo traci rozpuszczalnik i zestala się na rdzeniach. Tą metodą można mikrokapsułkować zarówno substancje nierozpuszczalne, jak i rozpuszczalne w wodzie. Jednak substancje te nie mogą się rozpuszczać w rozpuszczalniku organicznym, w którym przeprowadza się koacerwację. Do uzyskania otoczek używa się najczęściej pochodne celulozy.

B. Metoda polimeryzacji międzyfazowej – polega na wytworzeniu otoczek w wyniku polimeryzacji monomerów na granicy fazy rozpraszającej i rozproszonej. Fazą rozpraszającą jest woda, glicerol, etanol, a fazą rozproszoną – tłuszcze zwierzęce, oleje roślinne i syntetyczne, w których rozpuszcza się lub rozprasza substancję leczniczą oraz monomer (np. metakrylan metylu, octan winylu, mieszaninę styrenu i winylobenzenu). Mieszaninę tę emulguje się, np. wodą, tworząc emulsję typu o/w, dodając katalizatorów reakcji polimeryzacji. W wyniku reakcji tworzy się polimer nierozpuszczalny w oleju, który gromadzi się na granicy faz. Wytworzone mikrokapsułki oddziela się, przemywa i suszy.

C. Metoda topliwej dyspersji – polega na tworzeniu otoczek ze stopionego tworzywa rozproszonego w cieczy, która nie rozpuszcza ani rdzenia, ani tworzywa. Substancję, która ma stanowić otoczkę (woski, tłuszcze, parafinę stałą), rozprasza się w cieczy (oleje silikonowe, fluorowane etery cykliczne) i ogrzewa układ do jej stopienia. Następnie wprowadza się substancję leczniczą i podczas stałego mieszania układ się schładza. Stopione tworzywo otoczki w tym czasie zestala się na rdzeniach. Otrzymane mikrokapsułki oddziela się, przemywa i suszy.

D. Metoda z zastosowaniem obrotowego bębna – proces otrzymywania przeprowadza się w aparacie, składającym się z obrotowego bębna, mającego na obwodzie otwory, oraz z tarczy obracającej się w przeciwnym kierunku niż bęben. Do otworów doprowadza się płyn powlekający. Rdzenie podaje się na środek tarczy, skąd są odrzucane w warstwę substancji powlekającej. Mikrokapsułki zostają wyrzucone na zewnątrz do odbieralnika. Następnie utwardza się ścianki mikrokapsułek metodami fizycznymi lub chemicznymi.

E. Metody powlekania w warstwie fluidalnej lub w bębnie drażerskim – stosowany jest aparat Würstera, zwłaszcza dla rdzeni o średnicy mniejszej niż 100 µm.

Mikrokapsułki można tabletkować, dzięki czemu poprawia się właściwości postaci leku, można też uzyskać modyfikację uwalniania substancji leczniczych. W mikrokapsułkach można umieszczać substancje w postaci ciekłej lub nawet gazowej, a otoczkowanie ma swoje zalety takie jak w innych stałych postaciach (oddzielenie substancji wzajemnie reagujących, maskowanie smaku i zapachu).

Nanokapsułki

Nanokapsułki są to zestalone układy micelarne, zestalone mikroemulsje lub otoczone osłonką koloidalne układy ciał stałych. Nie są one widoczne okiem nieuzbrojonym, widoczne są jedynie w mikroskopie elektronowym. Otrzymywanie ich polega na wytworzeniu miceli zawierających wodny roztwór substancji leczniczej w fazie organiczno-olejowej. Do otrzymywanej w ten sposób mikrodyspersji dodaje się monomeru.

Monomery osadzone na powierzchni kulistej miceli poddaje się utwardzeniu przez polimeryzację. Ze względu na ich wielkość rozpatrywana jest możliwość ich zastosowania we wstrzyknięciach dożylnych i w kroplach do oczu.

Mikrosfery

Mikrosfery są to porowate mikrokulki o wielkości l—500 µm zbudowane są z polimerów, w których substancja lecznicza jest rozpuszczona lub zawieszona (inkorporowana) w matrycy polimerowej. Mikrosfery różnią się budową od mikrokapsułek i liposomów. W mikrokapsułkach substancja lecznicza występuje w postaci płynnej lub stałej i otoczona jest błoną polimerową. Cząstki te zbudowane są na bazie matrycy, dlatego jej ewentualne uszkodzenie nie ma istotnego wpływu na profil uwalniania substancji leczniczej. W zależności od właściwości zastosowanego polimeru możliwe jest osiągnięcie pożądanego profilu działania.

Mikrosfery mogą być podawane różnymi drogami: pozajelitowo, domięśniowo, dożylnie, podskórnie, doustnie np. jako wypełnienie kapsułek czy tabletek, do inhalacji, w implantacyjnych systemach terapeutycznych, a także w medycynie do embolizacji naczyń krwionośnych, jako transport środków wykorzystywanych w diagnostyce lub transport substancji do określonych narządów.

Mikrosfery nadal najczęściej mają zastosowanie jako leki do podawania pozajelitowego. Polimery stosowane do wytwarzania mikrosfer powinny być zgodne z tkankami i ulegać całkowitej biodegradacji chemicznej i/lub fizycznej. Mechanizm chemiczny polega na hydrolizie polimeru i w wyniku tego tworzeniu małych, rozpuszczalnych w wodzie oligomerów i monomerów. Mechanizm fizyczny polega na erozji matrycy polimerowej w wyniku wnikania płynu ustrojowego. Woda, wnikając w strukturę wewnętrzną polimeru, powoduje powolną degradację łańcucha polimerowego.

Polimery stosowane do wytwarzania mikrosfer powinny mieć takie cechy jak: biodegradowalność, biokompatybilność, plastyczność, łatwość dyfuzji substancji leczniczej, zgodność tkankowa. Do biozgodnych polimerów najczęściej stosowanych do wytwarzania mikrosfer podawanych pozajelitowo należą syntetyczne poliestry β- i ɑ-hydroksykwasów, np. kwasu polimlekowego i kwasu poliglikolowego, jak również kopolimery z obu tych grup oraz polietylenowęglany. Dzięki występowaniu różnej sekwencji monomerów istnieje wiele możliwości sterowania właściwościami polimeru. W celu zmniejszenia lipofilności i zwiększenia biodegradowalności polimerów zsyntetyzowano trójblokowe polimery takie jak: kopoli (L-mleczano-oksyetyleno-β-L-kwas mlekowy), a także pochodną polimleczano-ko-glikolanu o szczególnym przebiegu biodegradacji, który posiada gwiaździsto rozgałęzioną strukturę, w której łańcuchy kwasów poliglikolowych są związane z centralnie położoną cząsteczką glukozy.

Kopolimery kwasu mlekowego i glikolowego (PLGA) ulegają biodegradacji polegającej na hydrolizie wiązań estrowych. Produkty rozkładu kopolimeru są fizjologicznymi metabolitami. Szybkość biodegradacji zależy od proporcji ilościowych między jednostkami poszczególnych kwasów w układzie.

Do wytwarzania mikrosfer stosowane są też polimery pochodzenia naturalnego jak: albuminy, fibryna, kolagen, żelatyna, skrobia i chityna. Jednak te mają taką niedogodność, że mogą różnić się pod względem czystości i składu, a konieczność ich poprzecznego sprzęgania stwarza problemy z ich biokompatybilnością i immunogennością w zastosowanych matrycach polimerowych.

Mikrosfery z polimerami syntetycznymi można otrzymać metodą emulsyjną i metodą dyspersji. Metoda emulsyjna polega na emulgowaniu wodnego roztworu substancji leczniczej w niepolarnym roztworze polimeru. Metoda dyspersji polega na tym, że zawieszoną substancję leczniczą w organicznym roztworze polimeru rozprasza się za pomocą ultradźwięków lub homogenizatorów. W obu metodach mikrosfery tworzą się w trakcie usuwania rozpuszczalnika. Usunąć go można podczas procesu odparowania, ekstrakcji, wymrażania lub suszenia rozpyłowego.

– przykład z ekstrakcją rozpuszczalnika – wodny roztwór substancji leczniczej (w1) emulguje się w organicznym roztworze polimeru, potem otrzymaną emulsję w1/o rozprasza się w dużej objętości wodnego roztworu alkoholu poliwinylowego – faza (w2). Następnie apolarny rozpuszczalnik dyfunduje do fazy wodnej, w wyniku czego następuje koacerwacja polimeru na kropelkach fazy wodnej w1. Mikrosfery oddziela się i płucze.

– przykład z rozdziałem faz – w metodzie dodaje się do zawieszonej lub zemulgowanej substancji leczniczej tzw. separatora, zwykle oleju silikonowego. Separator zapoczątkowuje koacerwację polimeru na cząsteczkach substancji leczniczej. Po utworzeniu mikrosfer poddaje się je hartowaniu, następnie sączy i płucze.

– przykład z suszeniem rozpyłowym – w tym procesie roztwór lub zawiesinę polimeru i substancji leczniczej w rozpuszczalniku organicznym rozpyla się w strumieniu gorącego powietrza. Rozpuszczalnik powinien być łatwo lotny, a po odparowaniu jest regenerowany w odpowiednim urządzeniu. Suszenie rozpyłowe odbywa się w sposób ciągły, jest powtarzalną metodą i korzystnym procesem technologicznym. W procesie suszenia przerabia się znaczne ilości surowca, jest ona stosowana do produkcji w warunkach jałowych polimerowych mikrosfer z antybiotykami.

Mikrosfery wytworzone z albuminy lub żelatyny można otrzymać metodą żelowania. Po wytworzeniu emulsji wodnego albuminowego roztworu leku w oleju roślinnym wydziela się mikrosfery na drodze denaturacji termicznej albumin. Dla leków wrażliwych na temperaturę stosuje się żelowanie przez odwodnienie za pomocą rozpuszczalnika ekstrahującego wodę z kropli protein, np. alkoholu etylowego. We wszystkich metodach są używane rozpuszczalniki organiczne, które po sporządzeniu preparatu należy usunąć do ilości śladowych. Zwykle jest stosowana metoda suszenia próżniowego.

Długotrwałe uwalnianie z mikrosfer wykorzystuje się przede wszystkim w leczeniu nowotworów. Stosowane są mikrosfery z gosereliną, leuproreliną, a także z bromokryptyną. Mikrosfery można podać też dożylnie, bezpośrednio do tkanki nowotworowej, przez co dokonuje się embolizacji (zamknięcia naczynia). W celu uzyskania jałowych preparatów wykorzystuje się wyjaławianie za pomocą promieni ϒ. Preparaty z mikrosferami dostępne w lecznictwie składają się ze strzykawki i ampułek lub ampułkostrzykawki, w których obie fazy są osobno przechowywane.

Uwalnianie substancji leczniczej z matrycy polimerowej mikrosfer przebiega:
– na zasadzie kontrolowanej dyfuzji (dyfuzja przez pory) – woda przenika do mikrosfery i rozpuszcza pierwszą warstwę inkorporowanej substancji leczniczej. Wytworzone ciśnienie osmotyczne roztworu substancji leczniczej w głębszych warstwach matrycy polimerowej powoduje tworzenie się porów w kierunku powierzchni mikrocząstek. Pod wpływem wody wnikającej w głąb mikrocząstek tworzą się kanaliki, przez które substancja lecznicza dyfunduje z matrycy na zewnątrz. Nie występuje ubytek masy polimeru.
– kontrolowanej erozji matrycy (erozja matrycy) – następuje degradacja polimeru, w wyniku której inkorporowana substancja lecznicza zostaje uwolniona z matrycy.
– na zasadzie kontrolowanego pęcznienia – woda wnika do wnętrza i powoduje tworzenie się warstw spęczniałej matrycy, przez którą stopniowo dyfunduje substancja lecznicza.

Mikrosfery do podawania inhalacyjnego – pulmosfery – są to cząstki o bardzo dużej porowatości i niskiej gęstości. Pulmosfery otrzymuje się bez użycia polimeru metodą suszenia rozpyłowego przy udziale związku fluorowęglowego odpowiedzialnego za uzyskanie porowatej struktury oraz stabilizujących układ fosfolipidów. Dzięki swej strukturze pulmosfery łatwiej docierają do płuc w porównaniu do proszków.

Mikrocząstki (mikrosfery) do podawania doustnego – stosowane w celu poprawy wchłaniania substancji leczniczych lub w celu uzyskania przedłużonego działania. Mogą być też stosowane do doustnego podawania peptydów i białek, np. winkaminy i insuliny.

Do sporządzania doustnych mikrocząstek stosowane są:

kopolimery kwasu mlekowego i glikolowego (PLGA);
poli- ε-kaprolakton;
poliestry uretanu i polietylenotereftalanu;
polidioksanon;
polifosforoestry;
żelatyna.

Matrycę z PGLA zastosowano do inkorporowania antygenów i szczepionek, takich jak toksyna tężcowa, enterotoksyna B, szczepionka przeciwko malarii oraz dyfterytowi. Zaletą doustnego podania antygenów w postaci mikrocząstek jest wywoływanie silniejszej reakcji immunologicznej niż po podaniu antygenu w formie rozpuszczalnej. Jest to związane z wychwytywaniem mikrocząstek zawierających antygen przez kępki Peyera znajdujące się w ścianie jelit. W ten sposób uzyskuje się lepsze wchłanianie i kontrolowane uwalnianie. Aby mikrocząstki były wychwytywane przez limfocyty typu M pokrywające kępki Peyera, to ich wielkość oraz właściwości fizykochemiczne ich powierzchni muszą zapewnić odpowiednie przyleganie.

Wykazano, że mikrocząstki o wielkości mniejszej niż 5-10 µm są najłatwiej wychwytywane przez limfocyty typu M i mogą być stosowane w celu poprawy wchłaniania substancji leczniczych przez błonę śluzową, a o wielkości powyżej 10 µm w celu kontrolowanego uwalniania substancji leczniczych w przewodzie pokarmowym.

Stałe lipidowe układy matrycowe, nanocząstki lipidowe (Solid Lipid Nanoparticles, SLN)

Wytworzone zostały w celu doustnego podania zwłaszcza trudno rozpuszczalnych substancji leczniczych. Stałe nanocząstki lipidowe (SLN) to lipidowe nośniki o wielkości od 50 nm do 1000 nm, które powinny być stałe w temperaturze pokojowej oraz w warunkach fizjologicznych. SLN mogą mieć też postać dyspersji wodnej. Usunięcie rozpuszczalnika w procesie suszenia liofilizacyjnego lub rozpyłowego umożliwia uzyskanie formy proszku. Mogą być zamykane w kapsułkach, tabletkowane po połączeniu z innymi substancjami pomocniczymi lub pakowane w saszetki. Wodne zawiesiny SLN mogą być stosowane jako lepiszcza w procesie granulacji fluidyzacyjnej lub ekstruzji.

Zalety SLN:

możliwość inkorporowania w matrycy lipidowej substancji leczniczych lipofilowych oraz w mniejszym stopniu hydrofilowych, a przez to zabezpieczenie ich przed degradacją chemiczną, np. hydrolizą;
korzystny wpływ na trwałość oraz poprawę biodostępności;
możliwość modyfikowania szybkości uwalniania substancji leczniczej.

Lipidy stosowane jako nośniki substancji leczniczych mogą zwiększać ich wchłanianie przez selektywny wychwyt w układzie limfatycznym. Szybkość uwalniania substancji leczniczej z SLN zależy też od aktywności enzymów lipaza/kolipaza. Małe nanocząstki, których wielkość mieści się w granicach od 120 nm do 200 nm, omijają krążenie wątrobowe oraz śledzionę.

Wadą dyspersji SLN jest:

duża zawartość wody w układzie;
możliwość inkorporowania do układu małej ilości substancji leczniczej;
możliwość wypychania substancji leczniczej na powierzchnię matrycy lipidowej w czasie przechowywania, zwłaszcza jeżeli matryca lipidowa jest sporządzona z wysoko oczyszczonych lipidów, co może powodować zmianę profilu uwalniania substancji leczniczej lub tworzenie odmian polimorficznych.

SLN są sporządzane z:

mieszaniny mono-, di-, triglicerydów (Witepsol, monostearynian glicerylu, behenian glicerylu, palmitynostearynian glicerylu) (korzystniejszy wpływ na poprawę rozpuszczalności w porównaniu do czystych triglicerydów);
kwasów tłuszczowych (kwas stearynowy, kwas palmitynowy, kwas behenianowy);
alkoholi tłuszczowych lub wosków (wosk pszczeli, palmitynian cetylu), które są stałe w temperaturze pokojowej oraz w temperaturze ciała ludzkiego.

W celu stabilizacji dyspersji SLN i zapobiegania ich aglomeracji stosuje się tenzydy (Lecytyny, Poloxamer 188 lub 407, Tyloxapol, Tween 20, 60, 80, cholan sodu, glikocholan sodu, sól sodowa kwasu taurodeoksycholowego, butanol i kwas butyrowy, chlorek cetylopirydyniowy, laurylosiarczan sodu, oleinian sodu, alkohol poliwinylowy, Cremophor EL). Przy doborze tenzydów lub ich mieszaniny należy wziąć pod uwagę ich masę cząsteczkową, strukturę chemiczną, ładunek, wartość HLB.

Nanostrukturalne nośniki lipidowe (Nanostructured Lipid Carriers, NLC)

Wytworzone zostały w celu doustnego podania zwłaszcza trudno rozpuszczalnych substancji leczniczych. Od SLN różnią się tym, że substancja lecznicza jest inkorporowana między łańcuchy kwasów tłuszczowych, warstwy lipidów lub gromadzi się w miejscach defektów warstwowych sieci krystalicznej matrycy lipidowej.

Matrycę NLC tworzą lipidy stałe i płynne o zróżnicowanej budowie przestrzennej. Lipidy takie krystalizują w niedoskonały sposób, tworząc przestrzenie, w których może być inkorporowana substancja lecznicza.

Zaletą NLC w porównaniu z SLN jest:

możliwość wprowadzenia większej liczby cząstek stałych;
większa zawartość substancji leczniczej;
łatwość modyfikowania uwalniania;
większa stabilność niż SLN.

Metody sporządzania stałych nanocząstek lipidowych:

homogenizacja wysokociśnieniowa;
emulgowanie i odparowanie/dyfuzja rozpuszczalnika
emulgowanie i dyspergowanie z zastosowaniem ultradźwięków lub mieszadeł szybkoobrotowych;
tworzenie mikroemulsji;
podwójne emulgowanie z utworzeniem emulsji wielokrotnej.

Na skalę przemysłową największe znaczenie mają:

metoda homogenizacji wysokociśnieniowej;
emulgowanie z odparowaniem lub dyfuzją rozpuszczalnika.

Homogenizacja wysokociśnieniowa może przebiegać:
– na ciepło (rozpuszczanie substancji leczniczej w temperaturze wyższej niż temperatura topnienia lipidu);
– na zimno (rozpuszczanie lub zawieszanie, gwałtowne chłodzenie, np. w ciekłym azocie, suchym lodzie, mielenie). Następnym etapem w metodzie otrzymywania jest dyspergowanie w roztworze tenzydu (w metodzie na ciepło – na ciepło), po czym kilkakrotna homogenizacja wysokociśnieniowa. Ostatni etap to tworzenie zawiesiny SLN, a w metodzie na ciepło – tworzenie nanoemulsji, chłodzenie i krystalizacja lipidu.

W metodzie emulgowania z odparowaniem rozpuszczalnika lub z dyfuzją rozpuszczalnika może być emulgowanie:

roztworu lipidu w rozpuszczalniku organicznym niemieszającym się z wodą;
w rozpuszczalniku organicznym częściowo mieszającym się z wodą, wysyconym wodą do stanu równowagi termodynamicznej;
w wodnym roztworze tenzydu.

Następnym etapem jest odparowywanie rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem przy ciągłym mieszaniu lub dodawanie wody i dyfuzja rozpuszczalnika. Ostatni etap to wytrącanie lipidu i tworzenie SLN.

Wady i zalety metod:

W przypadku zastosowania metody homogenizacji na zimno eliminowane są problemy związane z brakiem trwałości substancji leczniczej w podwyższonej temperaturze, także z krystalizacją lipidów. Wadą tej metody jest większy rozrzut wielkości cząstek w porównaniu z metodami homogenizacji wysokociśnieniowej na ciepło.
W metodach homogenizacji wysokociśnieniowej na zimno i w metodzie emulgowania z odpowiedniego rozpuszczalnika unika się problemu rozkładu substancji leczniczej ze względu na niską temperaturę procesu.
Wadą metody emulgowania jest konieczność całkowitego odparowania rozpuszczalnika organicznego.
W metodzie emulgowania i dyspergowania z zastosowaniem ultradźwięków lub mieszadeł szybkoobrotowych wytworzona w czasie emulgowania fazy olejowej w fazie wodnej energia mechaniczna powoduje, że uzyskuje się emulsje o wielkości kropel fazy rozproszonej poniżej 1 µm. Wadą tej metody jest możliwość aglomeracji cząstek fazy lipofilowej podczas przechowywania. Zjawisku temu można zapobiec przez zwiększenie stężenia emulgatora, ale w bezpiecznym zakresie, ze względu na doustną drogę podania.

W metodzie tworzenia mikroemulsji stosowane jest łączenie dwóch faz o tej samej temperaturze, tj. ogrzanego wodnego roztworu tenzydu i kotenzydu z roztworem lub zawiesiną substancji leczniczej w stopionym lipidzie. Proces jest prowadzony w temperaturze wyższej od temperatury topnienia lipidów. Pod wpływem łagodnego mieszania tworzy się mikroemulsja, która następnie jest dyspergowana w wodzie o temperaturze od 2 do 10°C, zazwyczaj w proporcji od 1:25 do 1:50. W niskiej temperaturze lipidy mikroemulsji krystalizują w postaci nanocząstek. Z dyspersji tej woda jest usuwana przez suszenie liofilizacyjne lub ultrafiltrację.

Metodą z utworzeniem wielokrotnej emulsji typu w/o/w sporządza się stałe nanocząstki lipidowe z hydrofilowymi substancjami leczniczymi. Faza wodna zawierająca substancję leczniczą, emulgowana w podwyższonej temperaturze ze stopionym lipidem, stabilizowana np. żelatyną, jest poddawana dyspergowaniu w fazie wodnej również z dodatkiem stabilizatorów.

SLN powstałe w tym procesie mają większe rozmiary niż sporządzone innymi metodami, dlatego mogą być ogólnie określane jako liposfery. Liposfery to stałe cząstki lipidowe o budowie matrycowej, tj. zarówno mikro-, jak i nanosfery lipidowe. Wielkość mikrosfer, jako cząstek o większych rozmiarach, nie przekracza 100 µm.

Biodostępność substancji leczniczych z nośników lipidowych może poprawiać podanie ich z pokarmami bogatymi w tłuszcz. W przewodzie pokarmowym nanocząstki lipidowe są trawione przez enzymy lipolityczne. Na powierzchni stałych cząstek lipidowych powstają mono- i diglicerydy. Po oderwaniu się ich od powierzchni cząstki lipidowej tworzą one micele, wewnątrz których znajduje się substancja lecznicza. Po wymieszaniu z solami kwasów żółciowych powstają mieszane micele, które ułatwiają wchłanianie substancji leczniczej do krwi lub limfy. W ten sposób postacie leku na bazie lipidów mogą zwiększać wchłanianie lipofilowych substancji leczniczych, jak również substancji o dużej masie cząsteczkowej.

Nanocząstki wchłaniają się łatwiej przez naczynia limfatyczne niż przez naczynia krwionośne. Substancje lecznicze, które są wchłaniane do limfy, omijają krążenie wątrobowe. Stopień wchłaniania substancji leczniczej przez naczynia limfatyczne zależy od długości łańcucha kwasu tłuszczowego. Wykazano, że triglicerydy długołańcuchowe są lepszymi promotorami wchłaniania niż triglicerydy średniołańcuchowe. Ich rozkład enzymatyczny jest spowolniony.

Zalety stosowania tych postaci leku to poprawa dostępności biologicznej, poprawa szybkości wchłaniania, ominięcie efektu pierwszego przejścia, przedłużone działanie.

dr n. farm. Regina Kasperek
Katedra i Zakład Farmacji Stosowanej
Uniwersytet Medyczny w Lublinie

Fot. Fotolia.pl

Piśmiennictwo:
1. Janicki S., Fiebig A., Sznitowska M. (red.). Farmacja stosowana. Podręcznik dla studentów farmacji. Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2008.
2. Jachowicz R. (red.). Postać leku. Optymalizacja leków doustnych i do oczu w nowoczesnej technologii farmaceutycznej. Wydawnictwo lekarskie. PZWL Warszawa 2013.
3. Bauer K.H., Frömming K.H., Führer C. (red. wyd. pol. Pluta J.). Technologia postaci leku z elementami biofarmacji. MedPharm Polska, Wrocław 2012.
4. Szymańska E., Winnicka K. Mikrocząstki w lecznictwie – właściwości i zastosowanie. Gazeta Farmaceutyczna 10, 40-42, 2009.
5. Muller R.H., Hildebrand G.E. (tłum. Jachowicz J., Kubis A.A., Klawe J.). Technologia nowoczesnych postaci leków. Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2003.

Ryc. 1. Przekrój przez liposom zbudowany z fosfolipidów, które w postaci dwuwarstwowej otaczają wewnętrzną fazę wodną (5)

Ryc. 2. Budowa mikrokapsułki i mikrosfery (5)