Enzymy w przemyśle farmaceutycznym.

Bardzo dawno, na długo przed tym, jak naukowcom udało się okryć jakie struktury biologiczne odpowiadają za katalizę, ludzie na całym świecie powszechnie stosowali enzymy pochodzące z natury. Już w czasach starożytnych ekstrakt z żołądków cielęcych, zawierających enzym chymozynę wykorzystywany był do koagulacji mleka w procesie produkcji serów. Znana i praktykowana od wieków jest również produkcja napojów alkoholowych wytwarzanych metodą fermentacji alkoholowej z surowców skrobiowych takich jak owoce, trzcina cukrowa, ziemniaki czy zboża. Do lat 60-tych XX wieku (czyli do czasu, gdy do wspomnianego procesu nie stosowano jeszcze dodatku specjalnie wyselekcjonowanych komercyjnych enzymów), hydrolizę skrobi w celu uzyskania fermentowanych produktów prowadzono z zastosowaniem dodatku słodu lub też specjalnie przygotowanego ryżu (tzw. koji). W latach 30-tych XX wieku do produkcji klarownych, stabilnych soków owocowych wykorzystywano – nie wiedząc jeszcze, że są to właśnie typowe enzymy – pektynazy. Jednak stosowanie to wówczas ograniczało się wyłącznie do obróbki miazgi i soku podczas przerobu owoców jagodowych i do depektynizacji soku z owoców ziarnkowych.

Historia odkrycia i początków świadomości naukowej enzymów sięga początków XIX wieku. Wtedy to zaczęto zwracać uwagę na fakt trawienia in vitro mięsa przez wydzieliny żołądka, jak również zaobserwowano rozkład skrobi do cukrów prostych za pomocą śliny lub ekstraktów z roślin. W wieku XIX również, w trakcie pracy nad drożdżową fermentacją cukrów do alkoholu, Louis Pasteur wywnioskował, że proces ten jest nierozerwalnie związany z procesami biologicznymi drożdży, które nazwał „fermentem”. Wówczas to przypuszczano, że te procesy mogą działać tylko w organizmach żywych. W roku 1878 Wilhelm Kuhne do opisania tych procesów użył po raz pierwszy słowa „enzym”, z greki oznaczającego „w zaczynie”. W późniejszych czasach termin ten odnoszono do nieożywionych substancji np. pepsyny, a słowo „ferment” stosowano, by opisać aktywność chemiczną wykazywaną przez żywe organizmy. Na początku XX wieku, praktycznie od roku 1907, gdy Edward Buchner za badania biochemiczne i odkrycie fermentacji bez udziału komórek otrzymał nagrodę Nobla w dziedzinie chemii, prace nad enzymami, ich rolą, sposobem działania posuwały się już lawinowo. Z każdym odkryciem dowiadywano się coraz to nowych informacji i tak jest do czasów obecnych. Wciąż jeszcze nie wiemy wszystkiego o enzymach, choć należy podkreślić, iż intensywny rozwój biochemii, który doprowadził do odkrycia budowy i sposobu działania wielu enzymów zawartych w żywych komórkach i wielkie postępy biotechnologii w ostatnich latach, pozwoliły na dalsze udoskonalenie ich zastosowania.

Do tej pory udało się sklasyfikować kilka tysięcy różnych enzymów (fermentów). Są one grupą działającą jako biokatalizatory reakcji biosyntezy i rozkładu w płynach ustrojowych wszystkich żywych organizmów. Mogą być złożone z samego białka (np. trypsyna, ureaza), przeważnie jednak z części białkowej (apoenzym) i niebiałkowej, którą stanowią małocząsteczkowe związki nieorganiczne, pochodne witamin czy atomy metali. Rolą niebiałkowych części enzymu jest działanie jako przenośnik elektronów, określonych atomów lub też ugrupowań chemicznych z jednego metabolitu na drugi. Część białkowa natomiast jest czynna wyłącznie w połączeniu ze składnikiem niebiałkowym – koenzymem. To ten element właśnie decyduje o swoistości enzymu, a zwykle i rodzaju reakcji. Enzymy w komórce występują pojedynczo lub też tworzą wieloenzymatyczne układy (np. układ oksydazy pirogronianowej), które katalizują kolejno następujące po sobie reakcje. Każda tkanka ma różniący się od siebie zestaw enzymów, aczkolwiek, co warte zaznaczenia enzymy działające w najprostszych i najbardziej złożonych organizmach są podobne. W żywym organizmie gro enzymów syntetyzowanych jest z zasady w nieczynnej formie (proenzym) i dopiero, gdy zachodzi taka potrzeba dochodzi do ich aktywacji. Opisywane struktury biorą aktywny udział w przemianie materii wszelkich istot żywych, a ich mechanizm działania polega na wiązaniu substratów w odpowiednim położeniu, które umożliwia zajście reakcji, a powstałe produkty są następnie uwalniane.

Enzymy na potrzeby przemysłu można otrzymywać z biologicznego materiału zarówno z roślin wyższych, zwierząt jak i bakterii czy grzybów niższych. Technologia ich pozyskiwania i produkcji jest wielce różnorodna i podobna do otrzymywania substancji białkowych. Na ten proces składają się głównie ekstrakcja w niskich temperaturach, oczyszczenie przez dializę lub sączenie molekularne, lecz również częstokroć liofilizacja (część enzymów zachowuje stosunkowo dużą trwałość w niskich temperaturach). W tym momencie większość enzymów i preparatów enzymatycznych mających wykorzystanie w przemyśle wytwarzanych jest na drodze hodowli wgłębnych mikroorganizmów w bioreaktorach (fermentatorach) zawierających odpowiednie podłoże mikrobiologiczne. Podczas wzrostu mikroorganizm metabolizuje składniki pożywki i syntetyzuje enzymy, które wydzielane są do podłoża.

Nomenklatura naukowa enzymów jest dość skomplikowana. Mianowicie, W latach 1956-1972 Komitet Nazewnictwa (ang. Nomenclature Commitee) Międzynarodowej Unii Biochemii i Biologii Molekularnej (ang. International Union of Biochemistry and Molecular Biology) opracował nazewnictwo, klasyfikację i podział enzymów. Każdy z enzymów charakteryzowany jest przez ciąg czterech segmentów cyfr, oddzielonych od siebie kropką, poprzedzonych literami EC: ECx.xx.xx.xx. Pierwsza z cyfr klasyfikuje enzymy według mechanizmu działania. Wyróżnia się 6 głównych klas. Należą do nich oksydoreduktazy (EC1) – przenoszące ładunki (elektrony i jony H3O+ – protony) z cząsteczki substratu na cząsteczkę akceptora (dehydrogenazy, oksydazy), transferazy (EC2) – odpowiedzialne są za przenoszenie danej grupy funkcyjnej (np. aminowej, tiolowej) z cząsteczki jednej substancji na cząsteczkę innej substancji (transaminazy, kinazy), Hydrolazy (EC3) powodują natomiast rozpad substratu pod wpływem wody (hydroliza), ale także prowadzą do rozczepienia między innymi wiązań C-C, C-O, C-N. Liazy (EC4) odpowiedzialne są za rozpad substratu bez hydrolizy oraz za rozszczepienie wiązań (C-C, C-O, C-N, inne) przez eliminację atomu i wytworzenie wiązania podwójnego. Izomerazy (EC5) zmieniają wzajemne położenie grup chemicznych bez rozkładu szkieletu związku, a ligazy (EC6) (syntetazy) powodują syntezę (połączenie) różnych cząsteczek; powstają wtedy wiązania chemiczne przy udziale energii z ATP. Kolejne liczby numeru EC określają podklasy i podpodklasy, a ostatnia to miejsce enzymu w podpodklasie. Na przykład dehydrogenaza mleczanowa ma numer kodowy EC1.1.1.27. Pierwsza liczba (1) oznacza, że enzym należy do klasy oksydoreduktaz. Druga liczba (1) informuje, że enzym należy do podklasy 1, gdzie znajdują się wszystkie oksydoreduktazy odłączające parę atomów wodoru od grupy H-C-OH. Trzecia liczba (1) określa podpodklasę 1, gdzie znajdują się wszystkie enzymy, przekazujące wodory odłączone z grupy H-C-OH na NAD+. Czwarta liczba (27), to numer przypisany temu enzymowi w obrębie podpodklasy EC.1.1.1. W nazewnictwie enzymów zaleca się stosowanie numeru EC, jednakże dopuszcza się też używanie innych nazw, określonych w odpowiedniej dokumentacji i zaleceniach. Mowa tu o nazwach zwyczajowych z przyrostkiem – aza, gdzie pierwszy człon określa reakcję, a drugi jej substrat (np. dehydrogenaza alkoholowa). Spora część enzymów jest nazywana także historycznie, jak np. pepsyna (słowo z greki pepsis – trawienie) czy papaina (enzym z owocu papai). Nazwy niektórych enzymów utworzono również poprzez dodanie przyrostka –zym do ogólnej roli cząsteczki, np. nazwa lizozym pochodzi od lizujących właściwości w stosunku do bakterii. Zdarza się też niejednokrotnie, że enzymy pojawiają się pod skrótami pochodzącymi od ich pełnych nazw.

Enzymy i preparaty enzymatyczne stosowane w różnych dziedzinach otaczają nas i są obecne w naszym codziennym funkcjonowaniu i my na pewno nie jesteśmy do końca świadomi, jak wiele produktów, których używamy na co dzień, zawiera je lub powstało właśnie dzięki nim. To ich efektywność, sprawność, specyficzność, łatwy sposób użytkowania przyczyniły się do bardzo powszechnego wykorzystywania tychże struktur w wielu gałęziach przemysłu. Pierwszym enzymem wyprodukowanym na skalę przemysłową na drodze fermentacji był w 1952 roku biokatalizator o nazwie Thermozyne. Jego produkcja zapoczątkowała opracowywanie nowych warunków technicznych jak i technologicznych, które pozwoliły na rozwinięcie produkcji wielkoprzemysłowej. Od tego momentu firmy wytwarzające enzymy inwestują w rozwój nowoczesnych, innowacyjnych technologii, by produkty były tańsze i doszło maksymalnie do skrócenia czasu ich otrzymania.

Obecnie enzymów używa się między innymi w przemyśle owocowo – warzywnym, mleczarskim, piekarniczym, winiarskim. Stosowane są także na dużą skalę w browarnictwie, gorzelnictwie, przemyśle biopaliwowym, drzewnym, papierniczym, a także gumowym i fotograficznym. Możemy spotkać je w detergentach, proszkach do prania, jak również w potrawach przeznaczonych dla niemowląt. Enzymy i preparaty enzymatyczne stanowią również ważny aktywny składnik kosmetyków jak peelingi i maski enzymatyczne, kremy czy preparaty rozjaśniające przebarwienia.

Niewątpliwie zastosowanie enzymów i preparatów enzymatycznych przyczynia się również do ochrony środowiska. Na przykład dodatek kompleksu enzymów, głównie celulolitycznych podczas recyklingu zużytego papieru wpływa na proces odbarwiania masy włóknistej z makulatury, gdzie katalizator kontaktując się z masą działa na przyspieszenie usuwania z niej zanieczyszczeń kleistych i uwalniania barwników i farb, skrobi jak również włókna zerowego. Ponadto zastosowanie od lat 90-tych ksylanazy do odbarwiania pulpy drzewnej, zdecydowanie ograniczyło ilość chemikaliów jak chlor czy tlenek chloru (IV). A wykorzystanie technologii enzymatycznej w produkcji leków, wpływa na istotne ograniczenie emisji gazów do atmosfery i toksycznych produktów ubocznych do wody (np. w przypadku wytwarzania antybiotyków laktamowych – DSM Pure Actives nawet o 50%). Warto wspomnieć, że enzymy są niezastąpione także w analityce laboratoryjnej i klinicznej. Ponadto stosuje się je w manipulacjach materiałem genetycznym, proteomice (np. za pomocą nukleaz można wycinać wadliwe skonstruowane odcinki DNA, a powstałe ubytki wypełniać odpowiednimi fragmentami pochodzących z komórek zdrowych tego samego gatunku). Odgrywają także dużą rolę w diagnostyce klinicznej, służą jako markery i indykatory. Wykrycie patologicznej zmiany poziomu określonych enzymów w stanach chorobowych pozwala wnioskować o lokalizacji i rodzaju zmian zachodzących w organizmie. Na przykład u chorych z nowotworami mózgu występuje patologiczny wzrost stężenia dehydrogenazy mleczanowej w płynie mózgowo – rdzeniowym; nadmierne podwyższenie się stężenia enzymu śliniankowego amylazy ma miejsce  przy śwince czy kamicy przewodów żółciowych, a zmiany patologiczne fosfatazy azotowej w osoczu wskazują na rożne choroby kości czy choroby wątroby z utrudnionym odpływem żółci.

W przemyśle farmaceutycznym wachlarz zastosowania enzymów jest również bardzo szeroki. Stosuje się je jako bezpośrednie produkty farmaceutyczne, są niezbędne do wytwarzania leków chemicznych (podczas procesu produkcji na przykład do usunięcia zbędnych chiralnych składników) czy wytwarzania syntetycznych i półsyntetycznych hormonów i steroidów. Dla przykładu, streptokinaza, aktywująca plazminogen rozkładający włóknik wykorzystywana jest przy zawałach mięśnia sercowego, gdy pacjenci nie kwalifikują się do leczenia metodami chirurgicznymi. Alfa-chymotrypsyna jest jednym z najbardziej znanych enzymów przeciwzapalnych. Tkankowy aktywator plazminogenu i urokinazę stosuje się w leczeniu choroby zakrzepowej. Laktaza pomaga w trawieniu laktozy. Streptodornaza ma zastosowanie w kuracjach zropiałych ran. Trombiny używa się miejscowo, np. przy krwawieniach wewnętrznych (z wrzodów żołądka), a asparaginazy w kuracjach białaczek. Enzymy trzustkowe (np. pankreatyna – wyciąg z trzustek wieprzowych zawierający lipazę, amylazę i proteazy) ułatwiają procesy trawienia i wchłaniania białek, tłuszczów i skrobi wywołane niedostateczną zewnątrzwydzielniczą czynnością trzustki w przewlekłym jej zapaleniu, okresie rekonwalescencji, stanach po operacji usunięcia trzustki lub żołądka. Kolagenoza i hialuronidaza natomiast stosowane są miejscowo w leczeniu problemów skórnych. W kuracji chorób zakaźnych zastosowanie znajduje  lizozym, zaś pepsyna polecana jest pacjentom w celu zwiększenia apetytu. Urokinaza, plazmina, tkankowy aktywator plazminogenu, chondroitynaza, dyspaza, hialuronidaza (HS) czy kolagenaza z powodzeniem mogą być używane w leczeniu chorób witreoretinalnych.

Enzymy mają również inne zastosowanie, używane są w tzw. Enzymatycznej Terapii Zastępczej, ERT (inaczej Enzymatyczne Leczenie Substytucyjne ang Enzyme Replacement Therapy). Polega ono na dostarczaniu do organizmu brakującego enzymu lub też jego zmodyfikowanej formy. Wpływa ono na złagodzenie objawów choroby, nie dochodzi jednak nigdy do całkowitego wyleczenia i co najważniejsze pacjenci zmuszeni są do końca życia przyjmować leki. Wykorzystanie ERT ma miejsce między innymi w przypadku chorób uwarunkowanych genetycznie, chorób nowotworowych, autoimmunologicznych, w lizosomalnych chorobach spichrzeniowych (LChS) jak mukopolisacharydozy, w zaburzeniach trawienia, miażdżycy jak również w chorobach o podłożu bakteryjnym, grzybiczym i wirusowym.

Enzymy można wprowadzić do organizmu drogami: doustną, pozajelitową lub wziewną. W lekach ERT przeznaczonych do dawkowania doustnego zastosowanie ma technologia wielokompartmentowej formy leku, gdzie dawka substancji aktywnej dzielona jest między mnogie mini, mikro i nanocząstki, które mogą stanowić jej zbiornik lub też nośnik. Kompartmenty jak minitabletki, peletki, mikrosfery, mikrokapsułki przeważnie zamyka się w kapsułkach lub też czasami tabletkuje. Poprzez takową formę podania można modyfikować uwalnianie enzymu uzyskując lek o opóźnionym, przedłużonym, spowolnionym lub kontrolowanym uwalnianiu.

Liposomy (w wypadku, gdy w liposomie zamknięte są enzymy, jednostkę tę nazywa się enzymosomem) to postać leku, przeznaczona również do stosowania wziewnego, która pozwala na dostarczenie enzymu do miejsca docelowego w organizmie oraz chroni go przed dezaktywacją.

Obecnie, w zwalczaniu wielu chorób, duże nadzieje wiąże się również z tzw. terapią wzmacniającą (EET, enzyme enhancement therapy). Polega ona na wprowadzeniu do organizmu cząsteczek pełniących rolę tak zwanych farmakologicznych białek opiekuńczych, których zadaniem jest podwyższenie aktywności resztkowej nieprawidłowych białek enzymatycznych bez obowiązku zastępowania ich prawidłowymi kopiami. Molekuły mające zastosowanie w EET cechują się dodatkowo możliwością przenikania przez barierę krew – mózg.

Oprócz enzymów, w przemyśle farmaceutycznym wykorzystuje się również niektórych z nich jako inhibitory, hamujące przebieg niekorzystnych procesów metabolicznych w organizmie. Są to substancje niebiałkowe. Przykładem mogą być np. inhibitory enzymów dodawane do past do mycia zębów utrudniające rozwój próchnicy, neostygmina jest inhibitorem AchE stosowanych u pacjentów z jaskrą, a w formie przewlekłej dny moczanowej używany jest allopurinol – inhibitor oksydazy ksantynowej. Na tej samej zasadzie w farmacji znalazły zastosowanie różnorodne aktywatory działania enzymów.

Podsumowując, obecnie wytwarzanie preparatów enzymatycznych i wykorzystanie enzymów na potrzeby przemysłu jest jednym z trendów rozwoju nauki. Z roku na rok wzrasta ilość i zwiększa się zasięg tejże produkcji, powstaje coraz więcej form gospodarczych specjalizujących się wyłącznie w wytwarzaniu tychże struktur. Mają one szeroki zasięg wykorzystania w wielu dziedzinach, a w przemyśle farmaceutycznym stanowią innowacje i wciąż jeszcze nie do końca odkryty i wykorzystany potencjał „z natury”.

mgr Michał Stawarczyk

Piśmiennictwo:
1. Ratledge C., Kristiansen B. [red.] Podstawy biotechnologii, Wydawnictwo Naukowe PWN. Warszawa, 2011
2. Stryer L, Biochemia Warszawa : Wydawnictwo Naukowe PWN, 1997
3. Ostróżka- Cieślik A. , Banek A., Sarecka- Hujar B. Sposoby wykorzystania enzymów w przemyśle farmaceutycznym W: Przegląd wybranych prac z zakresu enzymologii, Zdunek B., Olszówka M. [red.], Fundacja na rzecz promocji nauki i rozwoju TYGIEL, Lublin, 2016
4. Gawęcki J., Mossor – Pietraszewska T. [red.] Kompendium wiedzy o żywności, żywieniu i zdrowiu. Wydawnictwo Naukowe PWN. Warszawa, 2004: 85 – 126
5. Witwicki J., Ardelt A. Elementy enzymologii, Wydawnictwo Naukowe PWN. Warszawa, 1989
6. Desnick R.J. Enzyme replacement and enhancement therapies for lysosomal diseases. 2004;27(3):385-410.
7. Adamczak M., Bednarski W. Enzymatyczna synteza galaktiooligosacharydów i laktulozy w permeacie po ultrafiltracji serwatki. ŻYWNOŚĆ. Nauka. Technologia. Jakość, 2008, 6 (61): 105-117
8. Stańczak A., Kuliś B. Przewaga technologi enzymatycznej w produkcji leków – nowy światowy standard, Farmakoterapia, lek w Polsce, 2007-2008, 24 (7)
9. Rasor J.P., Voss E. Enzyme-catalyzed processes in pharmaceutical industry, Applied Catalysis A: General 221, 2001:145-158
10. Nowak D. Enzymy nowoczesne narzędzie technologiczne. Agro Przemysł, 2008, 2:28-30
11. Vellard M. The enzyme as drug: application of enzymes as pharmaceuticals Current Opinion in Biotechnology 2003, 14: 444-450
12. Prusek K., Kucharz E.J. Enzymatyczna terapia zastępcza w leczeniu mukopolisacharydoz. Reumatologia 2011, 49, 2: 122-125