09.2012 – „Przeciwciała monoklonalne – dynamicznie rozwijająca się grupa biofarmaceutyków.”

wrzesień 2012, nr 73/51 online

 

   Przeciwciała, czyli immunoglobuliny (Ig) są to białka wytwarzane przez w pełni zróżnicowane limfocyty B. Ich cechą charakterystyczną jest zdolność do swoistego łączenia się z antygenem. Stosowanie immunoglobulin w terapii ma stosunkowo długą historię. Preparatami immunoglobulin uzyskanymi z oczyszczonych i zagęszczonych surowic zwierząt poddanych procesowi uodparniania wzrastającymi dawkami antygenu są na przykład antytoksyny. Już w roku 1890,  Behring i  Kitasato wykazali, że antytoksyna błonnicza neutralizuje działanie egzotoksyny i że to działanie daje się przenosić na osobniki, które wcześniej nie uzyskały takiej odporności. Mimo stosowania coraz doskonalszych metod oczyszczania immunoglobulin uzyskanych poprzez immunizację zwierzęcia określonym antygenem, preparaty te dalekie są od jednorodności. Dodatkowo, co jest niezwykle istotne, każdy klon limfocytów B, który bierze udział w odpowiedzi immunologicznej wytwarza immunoglobuliny swoiście rozpoznające określony epitop (określony fragment struktury przestrzennej)  antygenu). Biorąc pod uwagę, że na antygenie może być kilka różnych epitopów, można przewidzieć powstawanie mieszaniny różnych przeciwciał, zasadniczo rozpoznających jeden antygen, ale reagujących z jego różnymi epitopami. Są to tak zwane przeciwciała poliklonalne. Tego typu przeciwciała nie sprawdzają się w wykrywaniu subtelnych różnic w budowie antygenów. Na przykład jeśli dwa antygeny różnią się tylko jednym epitopem, to przeciwciała poliklonalne rozpoznają obydwa antygeny. W związku z tym przeciwciała poliklonalne nie mogą być stosowane do wybiórczego atakowania na przykład komórek nowotworowych. Będące tematem tej publikacji przeciwciała monoklonalne (MAbs) są natomiast produkowane przez limfocyty stanowiące jeden klon, a więc identyczne, rozpoznające tylko jedną ściśle określoną determinantę antygenową. Należą do tak zwanych bioterapeutyków, czyli biologicznie czynnych substancji pochodzenia zwierzęcego lub ludzkiego, produkowanych metodami nowoczesnej biotechnologii. Wysoką specyficzność przeciwciał monoklonalnych  przeciwko antygenom obecnym na pewnych typach komórek patologicznych wykorzystuje się coraz szerzej zarówno w terapii jak i w diagnostyce [1]. Możliwości ich wykorzystania są szerokie: mogą wiązać się specyficznie z powierzchnią komórek nowotworowych  zabijając je, czy dostarczać w odpowiednie miejsce toksyczne związki lub promieniotwórcze izotopy niszczące wybrane komórki. Stosuje się je głównie w leczeniu chorób nowotworowych, chorób układu krążenia, zaburzeń immunologicznych oraz w diagnostyce. Przeciwciała monoklonalne stanowią obecnie najbardziej dynamicznie rozwijającą się gałąź biofarmaceutyków. Na rynku jest obecnie około 30 specyfików z tej grupy, a wartość dochodu, który przynosi rocznie ich produkcja przekracza 26mld dolarów. Otrzymywanie przeciwciał monoklonalnych na skalę przemysłową stało się możliwe dzięki odkryciu dokonanemu w 1975 roku przez zespół brytyjskich uczonych kierowany przez Cesara Milsteina (Nobel 1984). Uczeni ci dokonali fuzji komórek szpiczaka z limfocytami B pochodzącymi ze śledziony myszy immunizowanej specyficznym antygenem, przeciw któremu zamierzano otrzymać przeciwciało. Otrzymane komórki mieszańcowe, nazywane  hybrydomami  zachowały własności obu komórek macierzystych: „nieśmiertelność” komórek nowotworowych i zdolność do wydzielania specyficznych przeciwciał charakterystyczną dla limfocytów B. Metoda Milsteina jest aktualnie stosowana w celu otrzymywania przeciwciał monoklonalnych na skalę przemysłową. Po wspomnianej powyżej fuzji komórek  przeprowadza się eliminację komórek, które nie uległy połączeniu, a następnie selekcję hybrydom pod względem miana produkowanych przeciwciał, ich swoistości i powinowactwa do antygenu. Po tej złożonej procedurze wyselekcjonowane hybrydy klonuje się [2]. Przemysłowe hodowle prowadzi się w bioreaktorach o pojemności setek litrów. Z litra hodowli uzyskuje się około 100 g przeciwciał. Wadą otrzymywanych w ten sposób przeciwciał monoklonalnych jest ich obcogatunkowy charakter – są to tak zwane przeciwciała mysie. Ich dłuższe stosowanie wywołuje u ludzi odpowiedź immunologiczną, stąd w chwili obecnej stosowane są głównie jako środki diagnostyczne. Przeciwciała mysie łatwo można rozpoznać po charakterystycznej końcówce nazwy –omab. Należą do nich między innymi stosowane w diagnostyce aritumomab (rozpoznający epitop karcynogenu embrionalnego), sulesomab, stosowany w scyntygrafii zapalenia szpiku kostnego, czy używany w terapii pooperacyjnej raka jelita grubego edrecolomab. Aby zmniejszyć immunogenność przeciwciał mysich opracowano metody ich humanizacji, czyli upodobnienia do przeciwciał ludzkich [3]. Humanizacja polega na zastąpieniu poszczególnych regionów mysich przeciwciał ich ludzkim odpowiednikiem. Używa się w tym celu  technik rekombinacji DNA. W zależności od tego, jak duża część Ig uległa modyfikacji, wyróżniamy przeciwciała:

 

 – chimeryczne (zawierające 10-30% sekwencji  aminokwasowych mysich). Ich modyfikacja polega na poddaniu modyfikacji genetycznej, dzięki której na poziomie DNA dochodzi do zastąpienia regionu stałego łańcucha lekkiego i ciężkiego przeciwciała mysiego, analogicznymi fragmentami przeciwciała pochodzenia ludzkiego.
– humanizowane przeciwciała monoklonalne (zawierające do 10% sekwencji  aminokwasowych mysich). Metoda ich modyfikacji polega na pozostawieniu w cząsteczce przeciwciała obcogatunkowego wyłącznie regionów wiążących antygen (hiperzmiennych). Proces humanizacji przeciwciał wiąże się jednak z ryzykiem utraty specyficzności.

 

   Większość stosowanych aktualnie w lecznictwie przeciwciał monoklonalnych to przeciwciała chimeryczne lub humanizowane. Dla tych pierwszych charakterystyczna w nazwie jest końcówka –ximab, w języku polskim –ksimab, np. cetuximab wskazany w przerzutowym raku okrężnicy i lokalnym płaskonabłonkowym raku głowy i szyi czy rituximab, lek o szerokich wskazaniach, do których należy chłoniak, przewlekła białaczka limfocytowa i reumatoidalne zapalenie stawów.

   Przeciwciała humanizowane, o charakterystycznej końcówce nazwy: – umab stanowią największą grupę wśród dopuszczonych do lecznictwa przeciwciał monoklonalnych. Wśród nich są np. alemtuzumab, dla którego wskazaniem jest przewlekła białaczka limfocytowa, bevacizumab stosowany w przerzutowym raku jelita grubego, niedrobnokomórkowym raku płuca  i raku nerki, trastuzumab stosowany w raku sutka i raku żołądka, ipilimumab, dla którego wskazaniem jest zaawansowany czerniak i kilka innych preparatów. Czynione są również próby otrzymywania w pełni ludzkich przeciwciał monoklonalnych, całkowicie pozbawionych immunogenności w organizmie człowieka, oraz działania alergizującego. Już w roku 1980 w Wistar Institute of Anatomy and Biology w Filadelfii otrzymano stabilne hybrydomy produkujące monoklonalne przeciwciała ludzkie. Fuzji poddane były limfocyty B izolowane od pacjenta chorego na raka (myeloma) z peryferyjnymi limfocytami chorego na przewlekłe pancephalitis. Otrzymane komórki hybrydowe wydzielały ludzką immunoglobulinę M specyficzną w stosunku do wirusa odry.  Jednak wykorzystanie tej metody do otrzymywania np. leków nie jest możliwe z kilku przyczyn, do których należy brak odpowiednich ludzkich linii szpiczakowych oraz względy etyczne. W metodzie tej konieczna byłaby bowiem immunizacja ludzi, np. komórkami nowotworowymi, celem otrzymania uczulonych limfocytów B poddawanych następnie fuzji. Jedną z alternatywnych metod otrzymywania ludzkich przeciwciał monoklonalnych jest wykorzystanie techniki prezentacji białek regionu wiążącego antygen na powierzchni bakteriofagów (ang. – Phage Display) [4]. Inna metoda wytwarzania ludzkich MAbs polega na immunizacji odpowiednim antygenem myszy cierpiących niedobór odporności, których układ immunologiczny uprzednio rekonstruuje się poprzez podanie limfocytów z krwi obwodowej człowieka. Podobnie jak w poprzednio opisanych metodach, uczulone limfocyty B są następnie izolowane i łączone z komórkami szpiczaka.

   Alternatywna metoda produkcji ludzkich przeciwciał monoklonalnych polega na wykorzystaniu  myszy transgenicznych, u których mysie geny kodujące immunoglobuliny zostały zastąpione ludzkimi. Zmodyfikowane genetycznie myszy poddaje się następnie immunizacji antygenem [5].

   Zarejestrowane są pierwsze w pełni ludzkie przeciwciała monoklonalne, do których należy adalimumab, stosowany w leczeniu reumatoidalnego zapalenia stawów, denosumab zarejestrowany w leczeniu osteoporozy u kobiet po menopauzie czy oftamumab, wskazany w przewlekłej białaczce limfocytowej.

   Opracowane również zostały rozliczne sposoby zwiększania efektywności terapeutycznej przeciwciał monoklonalnych, głównie poprzez łączenie ich z różnymi aktywnymi biologicznie cząsteczkami takimi jak toksyny, cytokiny, chemioterapeutyki, radioizotopy, czy enzymy aktywujące leki. Wykorzystywany w tym przypadku jest fakt wiązania się przeciwciał w sposób trwały i specyficzny z antygenami zlokalizowanymi na powierzchni patologicznych komórek. Można je więc wykorzystywać jako sondy lokalizujące określone komórki, najczęściej nowotworowe lub zapalne. Przeciwciała mogą w tego typu preparatach pełnić  rolę przenośników leków przeciwnowotworowych, co znacząco zwiększa ich skuteczność i selektywność.

   Przeciwciała monoklonalne mogą być sprzęgane z immunotoksynami (rycyna, abryna, saporyna, dyfterotoksyna, alfa-sarcyna), wykazującymi bardzo wysoką aktywność (toksyczność). Na przykład do zabicia komórki nowotworowej wystarczy tylko jedna cząsteczka rycyny lub dyfterotoksyny. Problemem powodującym ograniczenia dla stosowania tego typu preparatów w lecznictwie jest fakt, że istnieje niewiele całkowicie swoistych antygenów nowotworowych. Powoduje to, że przeciwciała wiążą się nie tylko z komórkami nowotworowymi, ale również ze zdrowymi komórkami, co przy bardzo wysokiej toksyczności stosowanych immunotoksyn staje się niebezpieczne dla pacjenta [6]. Inną strategią stosowaną w celu podwyższenia efektywności przeciwciał monoklonalnych jest łączenie z nimi cytokin takich jak czynnik martwicy nowotworów (TNF), interleukina 2 (IL-2) czy interferon gamma (INF gamma). Cytokiny niezwiązane z przeciwciałami monoklonalnymi są wykorzystywane w immunoterapii nowotworów, jednak ich istotną wadą jest wysoka toksyczność oraz szereg działań niepożądanych. Połączenie cytokin z MAbs obniża toksyczność systemową i wydłuża okres ich półtrwania w surowicy. Pozwala również na ograniczenie działania immunomodulujacego do miejsc zmienionych chorobowo [7]. MAbs stosuje się również w tzw. radioimmunoterapii. Wykorzystuje ona w terapii nowotworów przeciwciała sprzęgnięte z izotopami. Metoda ta może być stosowana np. w leczeniu guzów litych. Przeciwciała sprzęgnięte z radioizotopami wykazują zdolność do zabijania komórek znacznie oddalonych od miejsca, w którym zostały związane, co jednak może  prowadzić do uszkodzenia zdrowych tkanek otaczających nowotwór [6].

   Podsumowując, przeciwciała monoklonalne stanowią niezwykle obiecującą i dynamicznie rozwijającą się grupę  biofarmaceutyków,  której pojawienie się zawdzięczamy rozwojowi  metod nowoczesnej biotechnologii. Z rozwojem tej grupy specyfików wiązane są ogromne oczekiwania, co skutkuje czasami przecenianiem ich wartości terapeutycznej. Przykładem może być cofnięcie w 2011 roku rekomendacji FDA do stosowania bevacizumabu w leczeniu raka sutka, ze względu na brak znaczących efektów terapeutycznych i istotne działania niepożądane [8].

Fot. Fotolia.com

[1]. George A.J.T., “The antibody molecule, Diagnostic and therapeutic antibodies”, wyd. 1, red. George A.J.T i Urch C.E. Humana Press, 2000, s.1-22
[2]. “Monoclonal antibodies production”, A Report of the Committee on Methods of Producing Monoclonal Antibodies Institute for Laboratory Animal Research National Research Council. National Academy Press, Waszyngton, 1999
[3]. Carter P., “Improving the efficacy of antibody-based cancer therapies”, Nat. Rev. Cancer 2001, 1(2): 118-129
[4]. Winter G., Griffiths A.D., Hawkins R.E., Hoogenboom H.R., “Making antibodies by phage display technology”, Annu. Rev. Immunol. 1994, 12:433-455
[5]. Clark M., Antibody humanization: a case of the “Emperor's new clothes?”, Immunol. Today 2000, 21(8): 397-402
[6]. Carter P., “Improving the efficacy of antibody-based cancer therapies”, Nat. Rev. Cancer 2001, 1(2): 118-129
[7]. Jain M., Kamal N., Batra S.K., Engineering antibodies for clinical applications, Trends Biotechnol. 2007, 25(7): 307-316
[8]. US Food and Drug Administration, http://www.fda.gov/