08.2012 – „Frakcjonowanie osocza.”

sierpień 2012, nr 72/50 online

 

 

   Osocze krwi to jej płynny składnik, w którym są zawieszone elementy morfotyczne. Osocze stanowi od 55% do 60% objętości krwi krążącej. Ludzkie osocze reprezentuje unikatowy kompleks biologicznego materiału zawierający ponad 200 biochemicznych składników, z których nie wszystkie zostały do końca poznane. Wśród nich znajdują się ważne glikoproteiny i białka, takie jak albuminy, różne klasy immunoglobulin, czynniki krzepnięcia, antykoagulanty, inhibitory proteaz i czynniki wzrostu. Skład jakościowy, jak i ilościowy poszczególnych składników osocza pokazuje tabela 1. Różne składniki występują w różnych zakresach stężeń, od ok. 40 g/l dla albumin do zaledwie 1 pg/l dla czynnika wzrostu. Podobnie jest w przypadku mas molekularnych białek osocza, ich waga waha się od kilku milionów Daltonów dla kompleksu czynnika von Willebranda do jedynie kilku tysięcy Daltonów [1]. Osocze w organizmie odpowiedzialne jest za utrzymanie na stałym poziomie pH, temperatury, składu chemicznego, ciśnienia osmotycznego, stabilności koloidów i zawiesin komórek krwi, lepkości oraz napięcia powierzchniowego. Jest również podstawową drogą do wymiany składników tkankowych takich jak hormony, witaminy, aminokwasy, końcowe produkty przemiany materii, elektrolity, woda i enzymy. W osoczu znajdują się czynniki odpowiadające za jego płynność, jak również immunoglobuliny chroniące ustrój przed drobnoustrojami [2].

   Osocze pozbawione elementów morfotycznych może być stosowane jako samodzielny produkt leczniczy (osocze terapeutyczne) lub stanowić surowiec do otrzymywania produktów krwiopochodnych. Głównymi białkami wykorzystywanymi do produkcji leków są albuminy i immunoglobuliny, stanowiące ok. 80% wszystkich białek osocza. Innymi ważnymi terapeutycznie składnikami osocza wykorzystywanymi w produkcji farmaceutycznej są czynnik krzepnięcia VIII, antytrombina III oraz α1-antytrypsyna [3].

   W 1935 r. powstał przy Szpitalu Polskiego Czerwonego Krzyża w Warszawie pierwszy ośrodek zajmujący się krwiolecznictwem w Polsce. W 1945 r. w Łodzi została założona pierwsza w kraju stacja przetaczania krwi. Początek Honorowego Krwiodawstwa w Polsce datowany jest na rok 1958 [4]. Od tego czasu Polska posiada cenny surowiec – krew od dawców. Osocze przeznaczone do frakcjonowania pochodzi od około 10 tysięcy zdrowych dawców krwi, u których nie stwierdzono obecności antygenu HBs, przeciwciał anty-HIV-1/2 i anty-HCV [5]. Osocze pozyskiwane jest poprzez wirowanie krwi pełnej lub w procesie plazmaferezy [3]. Osocze i pule osocza z którego są otrzymywane produkty lecznicze, a także leki gotowe muszą bezwzględnie odpowiadać wymaganiom WHO oraz europejskim i polskim przepisom z tego zakresu [6,7,8]. Przestrzeganie stosowania przepisów jest regularnie weryfikowane przez inspektorów podlegających Głównemu Inspektorowi Farmaceutycznemu w Warszawie.

   W 1993 r. w myśl zaleceń Rady Europy Polska rozpoczęła realizację programu samowystarczalności w zakresie zaopatrzenia w produkty krwiopochodne. W 1994 r. po raz pierwszy w Ministerstwie Zdrowia powstał projekt wybudowania w Polsce fabryki frakcjonującej osocze [9]. Niestety do dnia dzisiejszego nie doszło do jej uruchomienia.

   W grudniu 2010 r. Ministerstwo Zdrowia ponownie ogłosiło konkurs na budowę fabryki osocza na terytorium Polski. Zgodnie z warunkami konkursu, inwestorzy musieli posiadać zabezpieczone środki na całość inwestycji – budowę fabryki i uruchomienie produkcji. Ponadto powinni określić wielkość przerobu osocza w litrach oraz harmonogram jego osiągnięcia w oparciu o osocze pochodzące od polskich dawców. Inwestor miał także zobowiązać się do zakupu min. 120 tys. litrów osocza rocznie od Regionalnych Centrów Krwiodawstwa i Krwiolecznictwa [10]. Resort zdrowia ogłosił, że do rozmów w sprawie budowy i uruchomienia fabryki frakcjonowania osocza przystąpiło konsorcjum Octapharma AG [11]. Fabryka osocza ma powstać do końca 2015 roku i umożliwić produkcję leków krwiopochodnych. Z polskiego osocza mają być wytwarzane produkty lecznicze: czynnik VIII, czynnik IX, czynnik VIII zawierający czynnik von Willebranda, albumina, immunoglobulina i kompleks zespołu czynników protrombiny [10].

   W Polsce uzyskuje się ok. 250 tys. litrów osocza rocznie (ok. 97 proc pochodzi z  krwi pełnej), z czego do celów klinicznych (osocze terapeutyczne) zużywa się ok. 30 proc. osocza pochodzącego od honorowych dawców. Pozostała nadwyżka – ok. 70 proc. (ok. 180 tys. litrów rocznie) powinna zostać przeznaczona do przetwarzania w leki, m.in. na hemofilię. Obecnie nadwyżka osocza jest sprzedawana firmom, które wywożą ją do innych krajów [12, 13].

   Obecnie w lecznictwie wykorzystywanych jest ponad 30 różnych rodzajów produktów krwiopochodnych [1]. W tabeli 2 został zamieszczony spis produktów krwiopochodnych aktualnie produkowanych na świecie i ich główne zastosowania. Prognozowany jest wzrost zastosowania tego typu leków szczególnie w krajach rozwiniętych, zawłaszcza zapotrzebowanie na poliwalentną immunoglobulinę do podania dożylnego (IVIG) [14]. Preparaty IVIG posiadają w swym składzie biologicznie aktywne cząsteczki gammaglobulin, dzięki czemu są stosowane w profilaktyce i terapii zakażeń bakteryjnych i wirusowych [15,16].

   Głównym białkiem osocza ludzkiego jest albumina, która w 80% odpowiada za utrzymanie prawidłowego ciśnienia onkotycznego. Bierze udział w wiązaniu różnego rodzaju ligandów takich jak wolne kwasy tłuszczowe, wapń, niektóre hormony steroidowe, bilirubina, a także część tryptofanu [2]. Albumina jest wytwarzana w postaci roztworu o stężeniu 5%, gdzie jako rozpuszczalnik stosowane są różne substancje między innymi izotoniczny roztwór NaCl, 5% roztwór glukozy, płyn wieloelektrolitowy i płyn Ringera oraz jako 20% roztwór rozpuszczony w wodzie do wstrzykiwań.

 

   Istotną rolę terapeutyczną pełnią uzyskiwane z fizjologicznego osocza czynniki krzepnięcia, które są białkami niezbędnymi do prawidłowego przebiegu kaskady wykrzepiania krwi, między innymi czynniki VIII czy IX. Preparaty zawierające czynnik VIII stosowane są u chorych na hemofilię A lub z nabytym niedoborem czynnika VIII. Zastosowanie tego preparatu ma na celu podwyższenie aktywności prokoagulacyjnej czynnika VIII w osoczu. Z kolei podawanie koncentratu czynnika IX powoduje podwyższenie aktywności czynnika IX w osoczu, co czasowo koryguje zaburzenia krzepnięcia u chorych. Preparaty zawierające ten czynnik podawane są chorym na hemofilię typu B (choroba Christmasa). Dostępne są także preparaty zawierające mieszaninę czynników krzepnięcia, mianowicie: protrombinę (czynnik II), prokonwertynę (czynnik VII), czynnik przeciwhemofilowy B (czynniki IX), czynnik Stuarta (czynnik X). Stosowane są w zapobieganiu i leczeniu krwawień, jak również podczas przygotowania do operacji chirurgicznej chorych z niedoborami czynników krzepnięcia.

 

   Kolejnym wykorzystywanym szeroko składnikiem osocza jest fibrynogen. Preparaty fibrynogenu stosowane są w krwawieniach i w zabiegach chirurgicznych u pacjentów z wrodzoną afibrynogenemią lub dysfibrynogenemią, rzadziej natomiast w nabytych zespołach odwłóknienia i fibrynolizy. Stosuje się stężone preparaty fibrynogenu oraz krioprecypitat za pomocą których stężenie fibrynogenu zostaje zwiększone do 2 – 4 g/l [17]. Fibrynogen jest także składnikiem preparatu złożonego. Jest to zestaw 4 fiolek zawierających różne substancje: 1-fibrynogen, 2-aprotyninę, 3-trombinę, 4-chlorek wapnia [17]. Po połączeniu składników zgodnie z instrukcją producenta powstaje klej tkankowy. Jego zastosowanie obejmuje leczenie wspomagające w przypadku niedającego się opanować krwawienia z niewielkich naczyń tętniczych i żylnych. Jest szczególnie pomocny w krwawieniach powierzchniowych, do klejenia i opatrywania ran, wzmacniania szwów oraz uszczelniania jam ciała i przestrzeni podpajęczynówkowej [16].

 

   Szeroko stosowane w lecznictwie są także produkty zawierające wysokie miano immunoglobulin specyficznych (patrz tabela 2), dostępne na rynku polskim zarówno w formie dożylnej jak i domięśniowej.

   W latach 40-tych XX wieku po raz pierwszy uzyskano oczyszczony preparat ludzkich immunoglobulin i albuminy metodą frakcjonowania białek osocza w niskiej temperaturze, przy użyciu etanolu wg Cohna [18]. Metoda ta została opracowana przez Cohna i jego współpracowników na uniwersytecie w Harwardzie w celu otrzymywania głównie albuminy. Jednakże metoda ta wraz z rozwojem technologii oraz usprawnieniem procesu pozwoliła na uzyskiwanie szeregu innych przydatnych w medycynie produktów. Obecnie frakcjonowanie wg Cohna z późniejszymi modyfikacjami jest podstawową metodą stosowaną do wytwarzania produktów krwiopochodnych. Ciągły rozwój technologii w dziedzinie oczyszczania białek osocza, a szczególnie zaś rozwój chromatografii w ostatnich latach umożliwił otrzymywanie produktów o zwiększonej czystości i jakości. Do tego czasu z 1 litra osocza otrzymywano 2,7g – 3,2g IgG, zaś wprowadzenie głębokiej filtracji i oczyszczania chromatograficznego poprawiły wydajność do 3,5g – 4,5g z 1 litra osocza [19]. Część producentów wprowadza metody przetwarzania chromatograficznego do standardowej produkcji. Dodatkowo prowadzone są nieustanne badania nad możliwościami zastosowania preparatów krwiopochodnych w schorzeniach leczonych dotąd tradycyjnymi lekami.

   Niestety nowe technologie są bardzo drogie, a co za tym idzie ceny leków również są wysokie. Może to doprowadzić do sytuacji, że w krajach rozwijających się lub uboższych lekarstwa tego typu będą niedostępne dla pacjentów ze względów ekonomicznych. Dlatego ważnym jest, aby udoskonalać dotychczasowe tradycyjne, tańsze metody produkcyjne, dzięki którym biedniejsze kraje będą mogły zapewnić sobie samowystarczalność [19, 20, 21].

   Ta wieloetapowa metoda polega na strącaniu na zimno poszczególnych białkowych składników osocza poprzez zmianę stężenia etanolu, siły jonowej, pH i temperatury wykorzystując ich punkty izoelektryczne. Metoda wg Cohna składa się z następujących etapów dokładnie opisanych w literaturze [18, 21, 22]:

 

Etap I – Otrzymywanie osadu I

   Osocze do frakcjonowania schładza się do temperatury 0^oC nie dopuszczając do zamarznięcia poprzez ciągłe mieszanie. Następnie wkrapla się 53% etanolu schłodzonego do -5^oC oraz mieszaninę etanolu i octanu sodu. Podczas wkraplania kontroluje się temperaturę mieszaniny, która ma się utrzymywać na poziome od -3 do -2,5^oC. pH mieszaniny powinno wynosić 7,2; siła jonowa 0,14; stężenie alkoholu 8%. Strącony osad odwirowuje się w schłodzonej wirówce. Pozostały nadsącz I poddaje się dalszemu frakcjonowaniu. Głównym składnikiem osadu jest fibrynogen. Osad rozpuszcza się w buforze cytrynianowym o pH=6,1 i sile jonowej 0,3 a następnie sterylizuje i poddaje procesowi liofilizacji. Liofilizat przechowuje się w temperaturze do 2 do 8^oC.

 

 

   Nadsącz I schładza się do temperatury -5^oC ciągle mieszając, następnie wkrapla się (przez 5 godzin) schłodzoną do temperatury -5^oC mieszaninę zawierającą 53% etanolu, 10M kwasu octowego, 4M octanu sodu i 95% etanolu. Siła jonowa powinna wynosić 0,09, pH=6,9, a temperatura mieszaniny -5^oC. Strącony osad odwirowuje się w schłodzonej wirówce. Pozostały nadsącz II+III poddaje się kolejnemu etapowi frakcjonowania. Osad oczyszcza się w celu oddzielenia gammaglobuliny, izoaglutyniny, protrombiny, plazminogenu i lipoprotein.

 

   Do nadsączu II+III dodaje się wody destylowanej utrzymując temperaturę na poziomie -5^oC. Buforem octanowym z wodą doprowadza się mieszaninę do pH=5,2. Stężenie etanolu wynosi 18%, a siła jonowa 0,09. Mieszaninę miesza się przez 1 godzinę i pozostawia na 6 godzin w temperaturze -5^oC do wytrącenia osadu. Strącony osad odwirowuje się w schłodzonej wirówce. Pozostały nadsącz IV-1 poddaje się kolejnemu etapowi frakcjonowania. Osad zawierający głównie alfa globuliny i lipoproteiny rozpuszcza się w 4 objętościach wody i liofilizuje.

 

   Do nadsączu IV-1 dodaje się wodnego roztworu zawierającego wodorowęglan sodu, 4M octan sodu. Bufor ten wkrapla się przez około 30 minut utrzymując temperaturę na poziomie -5^oC, następnie wkrapla się 95% etanolu schłodzonego do -5^oC. Stężenie alkoholu w nadsączu wzrasta do 40%, siła jonowa utrzymuje się na poziomie 0,09. Strącony osad odwirowuje się w schłodzonej wirówce, pozostały nadsącz IV-4 poddaje się kolejnemu etapowi frakcjonowania. Osad zwiera alfa i beta globuliny, niewielką ilość albuminy oraz esterazę i hypertensynogen.

 

 

   Nadsącz IV-4 filtruje się w celu oddzielenia nierozpuszczalnych zanieczyszczeń. Następnie do nadsączu przez 2 godziny dodaje się roztworu o składzie: 10M kwasu octowego, 4M octanu sodu, 95% etanolu i wody. Temperatura mieszaniny powinna być utrzymywana na poziomie -5^oC, pH nadsączu obniża się do wartości 4,8, stężenie etanolu wynosi 40% a siła jonowa nie przekracza 0,11. Mieszaninę odstawia się na 3 godziny w temperaturze -6^oC do wytrącenia osadu. Strącony osad odwirowuje się w temperaturze -5^oC. Głównym składnikiem osadu jest albumina z dodatkiem niewielkiej ilości alfa i beta globulin. Osad V poddaje się następnie oczyszczaniu w celu otrzymania czystej albuminy.

 

    Do oczyszczenia osadu II+III z pozostałych składników osocza w celu uzyskania czystej gammaglobuliny stosuje się metodę Oncley`a. [23]. Metoda ta składa się z następujących etapów:

 

Etap I – Otrzymanie osadu II+IIIw

   Osad II+III zawiesza się w zimnej wodzie zawierającej skruszony lód. Do powstałej zawiesiny dodaje się wody z dodatkiem 0,5M roztworu wodorofosforanu sodu. Zawiesinę miesza się w temperaturze 0^oC aż do rozpuszczenia osadu i powstania klarownego roztworu. Powstały roztwór rozcieńcza się wodą o temperaturze bliskiej 0^oC i miesza przez kolejne 30-60 minut, pH powinno wynosić 7,2 +/- 0,2. W następnym etapie dodaje się 53,3% etanolu schłodzonego do -5^oC w ten sposób uzyskuje się stężenie 20% etanolu. Całość miesza się jeszcze przez kilka godzin i odwirowuje w schłodzonej wirówce. Otrzymany osad II+IIIw poddaje się kolejnemu etapowi frakcjonowania.

 

 

   Osad II+IIIw zawiesza się w zimnej wodzie zawierającej skruszony lód. Do powstałej zawiesiny dodaje się wody z dodatkiem 0,35M octanu sodu. Następnie doprowadza się pH do wartości 5,2 +/- 0,1 za pomocą buforu octanowego. Całość miesza się kilka godzin dodając schłodzonej wody i 53,3% etanolu, uzyskując stężenie etanolu na poziomie 17%. Temperaturę mieszaniny obniża się do -6^oC i wiruje. Uzyskany osad zawiera głównie izoglutyniny, plazminogen i protrombinę. Nadsącz III poddaje się dalszemu frakcjonowaniu.

 

 

   Siłę jonową nadsączu doprowadza się do 0,05 poprzez dodanie 50mmol chlorku sodu na każdy kilogram osadu. Stężenie alkoholu pozostaje na poziomie 17%, pH=5,2 mieszaninę schładza się do -6^oC i wiruje. Otrzymany osad zwiera gammaglobulinę. Metoda oczyszczania osadu II+III zgodnie ze schematem Oncley`a pozwoliła na otrzymanie gamma globuliny o dużej czystości, jednakże wydajność tej metody okazała się być nie dość wysoka. Jedną z przyczyn może być trudność z utrzymaniem temperatur poniżej zera w czasie przeprowadzania całego procesu [19]. Poddając osady II+III wysokosprawnemu oczyszczaniu poprzez chromatografię powinowactwa możliwe byłoby uzyskanie podobnej ilości gammaglobuliny.

   Od kilku lat wprowadzane są do oczyszczania białek w frakcjonowaniu osocza techniki chromatograficzne. Chromatografia jonowymienna pozwala na oddzielenie cząsteczek białek dzięki wykorzystaniu wiedzy na temat ładunku zgromadzonego na cząsteczce. Fazę stacjonarną w tej metodzie stanowi wymiennik jonowy anionit lub kationit, do często stosowanych należą: DEAE Sephadex A50, DEAE-Toyopearl, QAE, CM Sepharose. Technika ta stosowana jest do otrzymywania: większości czynników krzepnięcia, inhibitorów proteaz, a także antykoagulantów. Cząsteczki związane z fazą stacjonarną wymywa się poprzez zmianę pH eluentu lub zmianę stężenia soli [19, 24, 25]. Z kolei chromatografia powinowactwa to rodzaj chromatografii adsorpcyjnej. W tej technice wykorzystuje się powinowactwo białka do ligandu, Wykorzystywane w tym celu są: ujemnie naładowana heparyna, żelatyna, lizyna oraz immobilizowane jony miedzi w żelu Sepharose Fast Flow. Cząsteczki wymywa się poprzez zmianę stężenia soli w eluencie. Ten typ chromatografii wykorzystywany jest do otrzymywania: antytrombiny, czynnika von Willebranda, plazminogenu i czynnika IX [19,26,27,28]. Kolejną wykorzystywaną techniką jest immunopowinnowactwo. Opiera się ona na wykorzystaniu przeciwciał monoklonalnych, skierowanych przeciwko konkretnemu białku, które ma zostać oddzielone. Wypłukiwanie cząsteczek przyłączonych do przeciwciał zachodzi poprzez zmianę stężenia soli w eluencie. Metoda ta znalazła zastosowanie w pozyskiwaniu czynnika VIII, czynnika IX oraz białka C [19].

 

   Podczas frakcjonowania osocza niezwykle ważne jest, aby cały proces był prowadzony pod ścisłymi restrykcjami narzuconymi przez przepisy dobrej praktyki wytwarzania (GMP) oraz aby było zapewnione bezpieczeństwo wirusologiczne zabezpieczone technicznie stosowaniem odpowiednich metod dezaktywacji wirusów. Od 2008 r., który zakończył okres przejściowy dla produktów krwiopochodnych pod względem dostosowania produkcji do przepisów prawa unijnego nie ma możliwości wprowadzenia na rynek Polski produktu tego typu bez zastosowania podczas wytwarzania zwalidowanej metody inaktywującej wirusy. Każdy etap produkcji podlega ścisłej kontroli jakości. Dodatkowym, ważnym elementem zapewnienia wysokiej jakości i bezpieczeństwa tych produktów dla pacjenta jest stosowanie kontroli wstępnej i seryjnej w niezależnym od producenta, akredytowanym laboratorium.

Fot. Fotolia.com

 

Piśmiennictwo:
1.    Plasma fractionation programmes for developing countries. Technical aspects and infrastructural requirements. WHO Regional Publications, 1999
2.    Pawelski S. Diagnostyka laboratoryjna w hematologii. PZWL Warszawa 1983
3.    Łysakowski K. Leki z osocza – problemy wytwarzania. Przemysł farmaceutyczny nr 4/2011
4.    www.pck.org.pl
5.    Bucholc B. Immunoglobuliny i zasady profilaktyki czynno-biernej. Przegl Epidemiol 57: 391-397, 2003
6.    Farmakopeia Europejska wyd. 7.0, 2010
7.    Requirements for collection, processing and quality control of blood, blood components and plasma derivatives (Requirement for Biological Substances No 27, revised 1992). In: WHO Expert Committee on Biological Standarization, Forty-three report. Geneva, WHO, 1994, Annex 2 (WHO Technical Report Series, No 840)
8.    Sabliński J, Łętowska M. Krwiodawstwo, zbiór przepisów dla placówek służby krwi. PZWL i Instytut Hematologii i Transfuzjologii, Warszawa, 1996
9.    Lisowska B. Bioton chce zostać frakcjonatorem osocza. Puls medycyny 1(144), Warszawa 2007
10.    MZ: w Polsce powstanie fabryka osocza. Jardan Pismo. Polish News No.270, 14.02.2012
11.    Komunikat MZ w sprawie fabryki przetwarzania osocza z dn. 13.02.2012, www.mz.gov.pl
12.    Lisowska B. Frakcjonowanie osocza: przetarg nadal nierozstrzygnięty. Puls medycyny 12(135), Warszawa 2006
13.    Komunikat MZ Podpisano umowę o sprzedaży nadwyżek osocza pomiędzy Regionalnymi Centrami Krwiodawstwa i Krwiolecznictwa a CSL Plasma GmbH z dn. 8.12.2010
14.    Farrugia A., Robert P. Plasma protein therapies: current and future perspectives. Best Practice & Research Clinical Haematology, Vol.19, No. I, 243-258, 2006
15.    Błaszczyk M. Wlewy dożylne immunoglobin G (IVIG) w leczeniu dermatologicznym. Przegląd dermatologiczny 6/91, 455-464, 2004
16.    www.pharmindex.pl/baza
17.    Kostowski W. Farmakologia. PZWL, Warszawa 2001
18.    Cohn E.J., Strong L.E., Hughes Jr W.L., Mulford D.J., Ashworth J.N., Melin M. & Taylor HL. Preparation and properties of serum and plasma proteins. IV. A system for the separation into fractions of the protein and lipoprotein components of biological tissues and fluids. Journal of the American Chemical Society 68: 459-475, 1946
19.    Burnouf T. Modern Plasma Fractionation. Transfusion Medicine Reviews. Vol.21, No. 2: 101-117, 2007
20.    Berger M. A History of Immune Globulin Therapy, from the Harvard Crash Program to Monoclonal Antibodies. Current Allergy and Asthma Reports 2: 368–378, 2002
21.    Creager A. N. H. What Blood Told Dr Cohn: World War II, Plasma Fractionation, and the Growth of Human Blood Research. Stud. Hist. Phil. Biol. & Biomed. Sci., Vol. 30, No. 3, 377–405, 1999
22.    Cohn E.J., Gurd F.R.N., Surgenor D.M., Barnes B.A., Brown R.K., Deronaux G., Gillespie J.M., Kahnt F.W., Lever W.F., Liu C.H., Mittelman D., Mouton R.F., Schmid K., Uroma E. A system for the preparation of the components of human blood: quantitative procedures for the separation of the protein components of human plasma. Journal of the American Chemical Society 72: 465-474, 1950
23.    Neurath H., Bailey K. The proteins: chemistry, biological activity and methods. Academic Press, New York 1953
24.    Burnouf T., Burnouf-Radosevich M., Huart J.J., Goudemand M. A highly purified factor VIII concentrate prepared from cryoprecipitate by ion-exchange chromatography. Vox Sang 60(1): 8-15, 1991
25.    Curling J.M. Methods of plasma protein fractionation. Academic Press London: 77-91, 1980
26.    Burnouf-Radosevich M., Burnouf T. Chromatographic preparation of a therapeutic highly purified von Willebrand factor concentrate from human cryoprecipitate. Vox Sang 62(1):1-11, 1992
27.    Engvall E., Ruoslahti E., Miller E.J. Affinity of fibronectin to collagens of different genetic types and to fibrinogen. J. Exp. Med. 147(6):1584-95, 1 Jun 1978
28.    Feldman P.A., Harris L., Evans D.R., Evans H.E. Biotechnology of blood proteins. Colloque INSERM, 227: 63-68, 1993.