06.2012 – „Nowoczesna farmakoterapia i biotechnologiczne postaci leków.”
czerwiec 2012, nr 70/48 online
NOWOCZESNA FARMAKOTERAPIA
I BIOTECHNOLOGICZNE POSTACI LEKÓW
W dobie intensywnego rozwoju myśli naukowej, potencjału technologicznego i przemysłowego, coraz częściej wręcz na co dzień stykamy się z określeniem, że coś lub nawet ktoś jest „bio”. Jest biologia i biofizyka, jest chemia bioorganiczna i biokoordynacyjna itd. Jednak na początku wszystkiego była biotechnologia, i nie jest to kwestia ostatnich kilkudziesięciu czy kilkunastu lat, kiedy ta dyscyplina naukowa wręcz rozkwita, ale już 6000 lat p.n.e. zajmowano się biotechnologią wytwarzając np. piwo, wino, czy chleb. Zatem metody z zakresu biotechnologii wykorzystywane są od tysięcy lat. Zmienił się warsztat, zmieniły się metody, a i forma aplikacji produktów biotechnologicznych również uległa znaczącym modyfikacjom. My jako farmaceuci również jesteśmy zobligowani do posiadania wiedzy i swoistej świadomości biotechnologicznej z zakresu substancji biologiczne aktywnych i postaci leku otrzymywanych metodami biotechnologicznymi. Niezależnie od naukowych poglądów i dywagacji akademickich nad wyodrębnianiem się biotechnologii farmaceutycznej jako odrębnej dyscypliny naukowej, stosowanie metod biotechnologii i inżynierii genetycznej w wytwarzaniu środków leczniczych jest faktem. Biotechnologia staje się nauką interdyscyplinarną, z czego korzystają również farmaceuci zaprzęgając techniki i metody biotechnologiczne do tworzenia nowych, doskonalszych form substancji aktywnych biologicznie i postaci leków. Biotechnologia farmaceutyczna jest dla farmaceutów praktyków, szczególnie tych aptecznych dużym wyzwaniem, ponieważ konfrontuje ich dotychczasową wiedzę i poglądy z nowymi technikami i substancjami, których charakter wyraźnie odbiega od dobrze znanej chemii i analityki w klasycznym akademicko-zawodowym poznaniu. Termin „Biotechnologia Farmaceutyczna” oznacza najnowocześniejsze uzupełnienie tradycyjnej biotechnologii. Generalnie rzecz biorąc, biotechnologia farmaceutyczna skupia się na kilku zasadniczych elementach i kierunkach stanowiących swoistą całość prowadzącą do otrzymania nowych i nowoczesnych farmakoterapeutycznie leków. Są to: poszukiwanie nowych substancji biologicznie aktywnych, opracowywanie postaci leków zawierających biotechnologiczne substancje czynne, doskonalenie warsztatu technik biotechnologii farmaceutycznej, wytwarzanie i opracowywanie formuł farmaceutycznych szczepionek oraz aplikacja medyczna np. mitochondrialna terapia genowa, produkcja sztucznych tkanek i systemów kontrolowanego uwalniania substancji czynnych. Osobnym zagadnieniem jest problem społeczny, etyczny, ekonomiczno-prawny i aplikacyjny metod oraz produktów biotechnologii farmaceutycznej.
Jako pierwszy należy wymienić kierunek poszukiwania nowych substancji biologicznie aktywnych, szczepionek i środków diagnostycznych. Powyższe realizowane jest w kierunku otrzymywania antybiotyków, kwasów owocowych i dodatków do środków spożywczych, najczęściej przy użyciu technik fermentacyjnych, otrzymywanie różnorakich form rekombinowanych białek, za pomocą kultur drobnoustrojów, jak również produkcja enzymów. Na przestrzeni ostatnich lat obserwuje się znaczący wzrost liczby wielkocząsteczkowych substancji czynnych o charakterze rekombinowanych białek, szczepionek czy przeciwciał monoklonalnych wytwarzanych z użyciem „fabryk” biologicznych. Przykłady rynkowych produktów to np. czynnik wzrostu kolonii granulocytów, rekombinowany interferon-α i β, ludzka insulina, tkankowy aktywator plazminogenu.
Dość istotnym problemem nowoczesnej farmakoterapii jest postępujące zjawisko lekooporności, powodujące, że sprawdzone leki przeciwbakteryjne i wirusowe stają się nieskuteczne. Od opanowania chorób zakaźnych dzieli nas obecnie większy dystans niż jeszcze 20 lat temu. Postępujący rozwój lekooporności zmusza do biotechnologicznego opracowywania nowych substancji czynnych. Pomimo, że dysponujemy nowymi narzędziami (czułe techniki analityczne, banki danych do dereplikacji, wysokosprawny skrinning, synteza kombinatoryczna) należy sia bardzo spieszyć aby zapobiec cofnięciu w czasy przedantybiotykowe. Jednym z najważniejszych biologicznych źródeł nowych substancji czynnych na etapie walki z lekoopornością są przede wszystkim drobnoustroje. Dla przykładu bakterie i grzyby wytwarzają wielką ilość produktów przemiany materii o masie cząsteczkowej mniejszej niż 2000, które wykazują selektywną, zróżnicowaną profilowo aktywność farmakologiczną.
Wytworzenie drogą biotechnologiczną nowej cząstki farmakologicznie aktywnej nie kończy drogi ku stworzeniu gotowego produktu leczniczego, ponieważ każdy produkt leczniczy występuje w określonej postaci, która spełnia określone zadania w aspekcie maksymalizacji efektu leczenia, jak również jego bezpieczeństwa. I o ile biotechnologia ze swoimi metodami poszukiwawczo–analitycznymi różni się od typowej technologii chemicznej, to nie obserwuje się zasadniczego rozdziału pomiędzy klasyczną technologią postaci leku oferującą typowe formy takie jak tabletki, iniekcje, wlewy, maści czy czopki, a swoistą wyspecjalizowaną formą leku biotechnologicznego. Na porządku dziennym obserwujemy zjawisko polegające na tym, że cząsteczki aktywne farmakologicznie odkryte bądź wyprodukowane metodami „bio” zamykane są w typowe postaci leku, które znamy z codzienności pierwszego stołu. Dość znamiennym, ale i interesującym przykładem powyższych twierdzeń jest biosyntetyczna historia odkrycia statyn. Wszystko zaczęło się od zastosowania metod ukierunkowanego skriningu biologicznego, chemicznego oraz modeli receptorowych. I tak przy użyciu testów enzymatycznych można wykrywać substancje biologicznie aktywne o określonym mechanizmie działania, ale należy pamiętać, że współczynnik sukcesu może być wyrażony ilorazem 1:10 000 bądź mniejszym. Np. w testach hamowania reduktazy 3-hydroksy-3-metyloglutarylokoenzymu A znaleziono takie związki o charakterze poliketydów jak mewinolina (znana bardziej jako lowastatyna) z Aspergillus terreus czy kompaktyna (mewastatyna) z Penicilium brevicompactum, które są inhibitorami enzymu już w stężeniach nanomolarnych. Zakłócona zostaje biosynteza kwasu mewalonowego, co powoduje ograniczenie syntezy cholesterolu. Na uwagę zasługuje fakt, że zarówno lowastatyna jak i mewastatyna zostały odkryte metodami i technikami biotechnologicznymi, a w lecznictwie występują w typowych postaciach farmaceutycznych.
Z punktu widzenia teoretycznego liczba naturalnych substancji biologicznie czynnych jest praktycznie nieograniczona, jeśli zważymy na możliwości syntetyczne enzymów biorących udział w ich powstawaniu. W rzeczywistości ich liczba jest jednak ograniczona. W sytuacji coraz większego rozwoju biotechnologicznych metod poznawczych oraz bardziej szczegółowych i wyselekcjonowanych badań, spotyka się coraz częściej znane już związki i z reguły należy zbadać dziesiątki tysięcy kultur komórkowych, zanim odkryje się jakąś nową substancję aktywną, która ma zastosowanie kliniczne. W najlepszym przypadku ten wyselekcjonowany związek reprezentuje nowy mechanizm działania, z którego korzysta się do wytworzenia biotechnologicznego i/lub półsyntetycznego otrzymania właściwego leku. W związku z powyższym w terminologii biotechnologicznej funkcjonuje określenie skriningu substancji wiodących. Ustalenie „de novo” struktury jakiejś substancji naturalnej, również przy zastosowaniu nowoczesnych metod, nadal jest czasochłonne i drogie. Dlatego nieodzowne jest rozpoznanie i wyeliminowanie znanych związków w jak najwcześniejszym stadium poszukiwań. Taki proces nazywa się dereplikacją.
Niejednokrotnie dużo większym problemem od stworzenie postaci leku z substancją biologicznie czynną jest zapewnienie jej optymalnych warunków biodostępności. Możemy dysponować super nowoczesną i aktywną farmakologicznie cząstką, możemy obudować ją w równie nowoczesną postać farmaceutyczną, ale jeżeli nie zapewnimy odpowiednich parametrów biofarmaceutycznych, to próżny nasz trud i oczekiwanie na optymalny efekt leczniczy takiej postaci leku.
Dostępność biologiczna poprzedzona optymalną dostępnością farmaceutyczną ma istotne znaczenie dla skuteczności farmakoterapeutycznej substancji czynnej otrzymanej metodami biotechnologicznymi. W zakresie peptydów, białek i oligonukleotydów pojawiają się zasadniczo te same pytania dotyczące podawania, wchłaniania, biotransformacji i wydalania, a przede wszystkim skuteczności działania, co w przypadku leków otrzymywanych drogą standardowej syntezy chemicznej, dodatkowo jeszcze w formie małocząsteczkowej. Jednakże natura substancji czynnych produkowanych metodami biotechnologicznymi sprawia, że tradycyjny układ biofarmaceutyczny LADME jest nieporównanie trudniejszy do interpretacji, przewidywań i walidacji. Ogólne zasady farmakokinetyczno-dynamiczne dotyczą na równi układów konwencjonalnych jak i struktur otrzymywanych drogą biotechnologiczną. Jednakże leki produkowane metodami biotechnologicznymi, ze względu na ich podobieństwo do substancji endogennych, odznaczają się w zakresie swoich właściwości wieloma szczególnymi cechami.
Jednym z podstawowych problemów istniejących na drodze otrzymania biotechnologicznej i sprawnej klinicznie postaci leku jest bioanalityka. Aby scharakteryzować zależność między dawką a stężeniem i działaniem peptydów i białek, konieczne jest ilościowe określenie tych związków w osoczu, krwi lub innych płynach ustrojowych. Należy jednakże wziąć pod uwagę obecność w organizmie peptydów i białek występujących endogennie przed egzogennym ich dostarczeniem z postacią leku. Stąd konieczność uwzględnienia pewnych ściśle określonych wartości podstawowych (basis line), które należy uwzględniać w procedurze analitycznej. Wartości te mogą być stałe lub zmienne, mogą być regularne i nieregularne, mogą mieć charakter okołodobowy, czy nawet okołocykliczny. Dla przykładu w celu dokonania oceny farmakokinetyki insuliny i somatotropiny (substancje otrzymane biotechnologicznie i podane w formule typowej iniekcji) przed ich aplikacją stłumiono endogenne uwalnianie obu substancji przez infuzję adekwatnie – glukozy lub somatostatyny. W odróżnieniu od leków konwencjonalnych w analityce peptydów i białek stosuje się często testy immunologiczne, biologiczne, enzymatyczne i radioimmunologiczne z użyciem przeciwciał poli- i monoklonalnych. Jak ważny jest problem zwalidowanych metod bioanalitycznych może posłużyć przykład rekombinowanego interferonu γ, gdzie stwierdzono, iż po podaniu podskórnym w porównaniu do podania dożylnego, dostępność biologiczna była większa niż 100%. Wynikało to wyłącznie z fałszywie dodatnich wyników testu, spowodowanych przez nieznacznie zmodyfikowane produkty rozpadu tej substancji. Nie bez znaczenia dla tego typu struktur biologicznie czynnych jest np. interferencja wywołana efektami matrycowymi, czy specyficznymi białkami wiążącymi proteazy i krzyżowo reagującymi białkami endogennymi. Dużym ułatwieniem w bioanalityce biotechnologicznych form substancji czynnych i leków jest stosowanie technik HPLC, które w ostatnim czasie podlegają wręcz lawinowemu postępowi i w zakresie czułości są porównywalne z testami immunologicznymi. Często też mają większą selektywność.
Równie istotnym problemem pojawiającym się przy formułowaniu postaci leków z komponentą aktywną otrzymywaną drogą biotechnologiczną jest wchłanianie. Największą trudnością dla cząsteczek o budowie peptydowej i białkowej jest niewystarczający dopływ substancji do pożądanego miejsca działania. Dające się zastosować klinicznie, wchłanianie egzogennych peptydów i białek po podaniu doustnym jest z reguły nieosiągalne przy użyciu tradycyjnych form podawania leku. Wynika to z obecności w przewodzie pokarmowym peptydaz i proteaz oraz z faktu, że błona śluzowa żołądka i jelit jest znaczną barierą resorpcyjną. W przypadku peptydów przyczynia się do tego funkcjonalny system izoenzymu cytochromu P-450 3A4 oraz glikoproteina P. Z powodu niedostatecznego działania po podaniu doustnym w przypadku leków biotechnologicznych stosuje się najczęściej podanie donosowe, podpoliczkowe, doodbytnicze, dopochwowe, przezskórne, oczne lub nawet płucne. Często i z tymi drogami podawania wiąże się problem przedukładowych procesów rozpadu. Stąd dostępność biologiczna licznych peptydów i białek po podaniu podskórnym i domięśniowym jest w porównaniu z podaniem dożylnym wyraźnie zmniejszona. Organizacja bariery dystrybucyjnej to dla leków otrzymanych metodami biotechnologicznymi szczególnie o dużych cząsteczkach bardzo istotny problem. O ile w przypadku leków niebiałkowych istnieje sprawdzenie możliwości kumulowania się w tkankach, o tyle w przypadku leków białkowych i peptydowych ten problem nie występuje, ponieważ przedkliniczne i kliniczne opracowanie formy tych leków, może wiązać się z katabolicznymi produktami końcowymi będącymi aminokwasami nadającymi się do dalszego przetworzenia. Najwięcej problemów formulacyjnych w zakresie tworzenia biotechnologicznych postaci leku dają substancje czynne o charakterze białek. Proces tworzenia postaci leku musi być tak dobrany, aby nie dochodziło do zmiany struktury białka. Aby zapewnić maksymalną stabilność, a przez to efekt leczniczy stosuje się chłodzenie, zamrażanie lub liofilizację. Stosuje się substancje pomocnicze o charakterze stabilizatorów, tj. środki powierzchniowo czynne (np. polisorbaty) które zapobiegają adsorpcji powierzchniowej. Polimery (pochodne celulozy, dekstrany) zapobiegają agregacji niekonwalencyjnej. Aminokwasy (lizyna, arginina) zwiększają rozpuszczalność. Leki biotechnologiczne najczęściej podawane są w postaciach umożliwiających aplikację dożylną, domięśniową, podskórną lub dootrzewnową. Ponieważ okres półtrwania rzadko wynosi więcej niż kilka godzin, podawanie musi być częste, co z kolei jest uciążliwe dla pacjenta. Dlatego nowoczesne formy leków biotechnologicznych idą w kierunku domięśniowych i podskórnych form typu „depot”. Jako systemowe matryce przedłużające okres półtrwania stosuje się w iniekcjach domięśniowych i podskórnych polimleczan (PLA) oraz poli-(D,L-mleczan-co-glikolan) (PLGA). Matryce takie są biokompatybilne i nieimmunogenne. Przykładem powyższych rozwiązań są mikrocząstkowe aplikacje rekombinowanego ludzkiego hormonu wzrostu, erytropoetyny czy octanu leuproreliny i gosereliny. Iście kosmiczną technologią jest system PowerJect®, gdzie drobnym cząstkom proszku nadaje się za pomocą gazowego helu prędkość naddźwiękową. Tą techniką aplikuje się peptydy i białka drogą przezskórną i przezśluzówkową, np. insulinę, lidokainę i konwencjonalne szczepionki. Podobna do wyżej wymienionej jest technika GeneGun® polegająca na aplikacji DNA do skóry lub innej tkanki. DNA jest adsorbowane na cząstkach złota, a później „wstrzeliwane” do tkanki. Kolejnym rozwiązaniem technologicznym dla leków „bio” są pompy osmotyczne i samoregulujące się systemy uwalniania. System Alzet® używany jest do podawania białek i oligonukleotydów. Systemy te są zróżnicowane, posiadają różne objętości i różne szybkości uwalniania. Po 4-6 godzinach uzyskujemy równomierne uwalnianie substancji aktywnej. Odmianą systemów typu Alzet® są systemy samoregulujące na żądanie, znajdujące zastosowanie w cukrzycy, gdzie wydzielanie hormonu jest uzależnione od stężenia glukozy we krwi. System posiada wbudowany sensor, który kieruje uwalnianiem reagując na wcześniej zadane parametry. Również ciekawym rozwiązaniem technologicznym jest zastosowanie form leków biotechnologicznych podawanych drogą wziewną do płuc. Mimo, że już w 1925 roku stwierdzono, że insulina działa po podaniu wziewnym, to dopiero teraz na różnym etapie badań klinicznych znajdują się systemy wziewnego podawania insuliny. Np. system AERx® polega na rozpylaniu do formy mgły roztworu białka, przy czym wielkość kropli powstającego aerozolu można regulować. System taki może być aplikowany zarówno układowo jak i lokalnie.
Ostatecznym celem badań farmaceutycznych i technologii farmaceutycznej jest wyeliminowanie albo co najmniej złagodzenie choroby. Dzięki rozwojowi nauk biotechnologii farmaceutycznej otwierają się możliwości coraz trafniejszego doboru substancji biologicznie czynnych zamkniętych w wyselekcjonowanych i specyficznych formach postaci leków biotechnologicznych.
dr n. farm. Michał Krzysztof Kołodziejczyk
Specjalista Farmacji Aptecznej
Adiunkt w Zakładzie Technologii Postaci Leku
Katedra Farmacji Stosowanej
Uniwersytet Medyczny w Łodzi
Specjalista Farmacji Aptecznej
Adiunkt w Zakładzie Technologii Postaci Leku
Katedra Farmacji Stosowanej
Uniwersytet Medyczny w Łodzi
Fot. Fotolia
Piśmiennictwo:
1. Andric P., Meyer A.S., Jensen P.A., Johansen D.K.: Reactor design for minimizing product inhibition during enzymatic lignocellulose hydrolysis: I. Significance and mechanism of cellobiose and glucose inhibition on cellulolytic enzymes, Biotech. Adv. 2010, 28, 3, 308-324.
2. Bearer E.L., Orci L.: Endothelial fenestral diagrams: A quick-freeze, deep-etch study, J. Cell Biol., 1985, 100, 418-428.
3. Schuster J., Rubsamem R, Lloyd P., Lloyd J., The AERx aerosol delivery system, Pharm Res. 1997, 14, 354-357.
4. Edwards D.A., Hanes J.: Large porous particles for pulmonary drug delivery, Science, 1997, 276, 1868-1871.
5. Gansslen M. Über die inhalation von Insulin, Klin. Wochenschr, 1925, 4, 71.
6. Kayser O., Müller R.H.: Pharmazeutische Biotechnologie, WFmbH, 2000, Stuttgart, Germany, 113-126.
7. Moradpour Z., Ghasemian A.: Modified phages: Novel antimicrobial agents to combat infectious diseases, Biotech. Adv. 2011, 29, 6, 732-738
8. Perkins L., Peer C., Fleming V., Pumps/Osmotic – Alzet system, Encyclopedia of Controlled Dug Delivery, Vol. 2, JW & S Inc. New York, 1999, 900-906.
9. Dos Santos S.C., Teixeira M.C., Cabrito T.R., Sá-Correia I., Yeast toxicogenomics: genome-wide responses to chemical stresses with impact in environmental health, pharmacology, and biotechnology. Front Genet. 2012; 3, 63.
10. Kim S.W., Pai C.M.: Self-regulated glycosylated insulin delivery, J. Control. Rel., 1990, 11, 193-201.
11. Fasano A.: Novel approaches for oral delivery of macromolecules, J. Pharm. Sci., 1998, 87, 1351-1356.
12. Wacher V.J., Silverman J.A., Zhang Y., Benet L.Z.: Role of p-glycoprotein and cytochrome P-450 3A in limiting oral absorption of peptides and peptidomimetics, J. Pharm. Sci, 1998, 87, 1322-1330.
13. Wills R.J., Ferraiolo B.L.: The role of pharmacokinetics in the development of biotechnologically derived agents, Clin. Pharmacokinet, 1992, 23, 406-414.
14. Heller J.: Polymers for controlled parenteral delivery of peptides and proteins, Adv. Drug Deliv. Rev., 1993, 10, 163-204.
15. Cragg G.M., Newman D.J., Snader K.M., Natural Products in Drug Discovery and Development, J. Nat. Prod. 1997, 60, 52-60.
16. Omura S.: The Search for Bioactiv Compounds from Microorganisms, 1992, Wyd. 1 S-V, New-York.
17. Lippold B.C., Mȕller-Goymann C., Schubert R.:Lehrbuch der Pharmazeutischen Technologie, 2006, WVSB, Stuttgart, Germany.
18. Qu B., Qi X., Wu X., Liang M., Li C., Cardona C.J., Xu W., Tang F., Li Z., Wu B., Powell K., Wegner M., Li D., Xing Z.: Suppression of the Interferon and NF-κB Responses by Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome Virus. J Virol. 2012 May 23.
1. Andric P., Meyer A.S., Jensen P.A., Johansen D.K.: Reactor design for minimizing product inhibition during enzymatic lignocellulose hydrolysis: I. Significance and mechanism of cellobiose and glucose inhibition on cellulolytic enzymes, Biotech. Adv. 2010, 28, 3, 308-324.
2. Bearer E.L., Orci L.: Endothelial fenestral diagrams: A quick-freeze, deep-etch study, J. Cell Biol., 1985, 100, 418-428.
3. Schuster J., Rubsamem R, Lloyd P., Lloyd J., The AERx aerosol delivery system, Pharm Res. 1997, 14, 354-357.
4. Edwards D.A., Hanes J.: Large porous particles for pulmonary drug delivery, Science, 1997, 276, 1868-1871.
5. Gansslen M. Über die inhalation von Insulin, Klin. Wochenschr, 1925, 4, 71.
6. Kayser O., Müller R.H.: Pharmazeutische Biotechnologie, WFmbH, 2000, Stuttgart, Germany, 113-126.
7. Moradpour Z., Ghasemian A.: Modified phages: Novel antimicrobial agents to combat infectious diseases, Biotech. Adv. 2011, 29, 6, 732-738
8. Perkins L., Peer C., Fleming V., Pumps/Osmotic – Alzet system, Encyclopedia of Controlled Dug Delivery, Vol. 2, JW & S Inc. New York, 1999, 900-906.
9. Dos Santos S.C., Teixeira M.C., Cabrito T.R., Sá-Correia I., Yeast toxicogenomics: genome-wide responses to chemical stresses with impact in environmental health, pharmacology, and biotechnology. Front Genet. 2012; 3, 63.
10. Kim S.W., Pai C.M.: Self-regulated glycosylated insulin delivery, J. Control. Rel., 1990, 11, 193-201.
11. Fasano A.: Novel approaches for oral delivery of macromolecules, J. Pharm. Sci., 1998, 87, 1351-1356.
12. Wacher V.J., Silverman J.A., Zhang Y., Benet L.Z.: Role of p-glycoprotein and cytochrome P-450 3A in limiting oral absorption of peptides and peptidomimetics, J. Pharm. Sci, 1998, 87, 1322-1330.
13. Wills R.J., Ferraiolo B.L.: The role of pharmacokinetics in the development of biotechnologically derived agents, Clin. Pharmacokinet, 1992, 23, 406-414.
14. Heller J.: Polymers for controlled parenteral delivery of peptides and proteins, Adv. Drug Deliv. Rev., 1993, 10, 163-204.
15. Cragg G.M., Newman D.J., Snader K.M., Natural Products in Drug Discovery and Development, J. Nat. Prod. 1997, 60, 52-60.
16. Omura S.: The Search for Bioactiv Compounds from Microorganisms, 1992, Wyd. 1 S-V, New-York.
17. Lippold B.C., Mȕller-Goymann C., Schubert R.:Lehrbuch der Pharmazeutischen Technologie, 2006, WVSB, Stuttgart, Germany.
18. Qu B., Qi X., Wu X., Liang M., Li C., Cardona C.J., Xu W., Tang F., Li Z., Wu B., Powell K., Wegner M., Li D., Xing Z.: Suppression of the Interferon and NF-κB Responses by Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome Virus. J Virol. 2012 May 23.
