04.2014 – „Terapia fagowa.”

 

 

   Bakteriofagi, zwane również fagami, są wirusami, które do związku pasożyt-gospodarz wybrały bakterie jako swoich gospodarzy i reproduktorów. Na drodze ewolucji rozwinęły one mechanizmy umożliwiające zakażenie komórki bakteryjnej i w konsekwencji jej zniszczenia na drodze lizy, zaraz po utworzeniu setek potomnych wirionów. Fagi bytują między innymi w wodzie, glebie, ściekach oraz na skórze, w ślinie, w moczu i w przewodzie pokarmowym człowieka i zwierząt. Wszędzie, gdzie znajdujemy bakterie, obecne są również bakteriofagi. Naukowcy uważają, że stanowią one jeden z mechanizmów ograniczających nadmierną ekspansję bakterii w środowisku, w tym również w organizmie człowieka. Opisano dotąd ponad 5000 fagów aktywnych wobec wielu różnych gatunków bakterii. Większość fagów cechuje wysoka swoistość w stosunku do gospodarza, co pozwala na ich zastosowanie do określania przynależności gatunkowej bakterii oraz na różnicowanie szczepów bakteryjnych w obrębie tego samego gatunku (tzw. fagotypowanie). Swoistość fagów względem zakażanej komórki sprawia również, że nie potrafią one zakażać komórek organizmów wyższych, w tym ssaków, wiec nie są niebezpieczne dla organizmu człowieka.

 

   Bakteriofag posiada materiał genetyczny w postaci DNA (u ponad 90% fagów występuje dwuniciowy DNA) lub rzadko – RNA, który jest zamknięty w białkowym kapsydzie. Typowy fag ma kapsyd złożony z wielościennej bryły zbliżonej do kuli, zwanej główką, połączonej z podłużną kurczliwą strukturą, zwaną ogonkiem, przez który nić kwasu nukleinowego jest wstrzykiwana w trakcie zakażenia do komórki bakteryjnej. Rola kapsydu nie ogranicza się tylko do ochrony materiału genetycznego, ale także ma fundamentalne znaczenie w zakażeniu nowego gospodarza dzięki obecności swoistego białka wiążącego receptor, które jest odpowiedzialne za rozpoznanie wrażliwej, czyli podatnej na zakażenie komórki bakteryjnej. W trakcie zakażenia w cyklu litycznym, po wprowadzeniu wirusowego materiału genetycznego do wnętrza komórki bakterii, dochodzi do transkrypcji genów wirusowych, a metabolizm komórki gospodarza zostaje przestawiony na tworzenie potomnych cząstek fagowych. W jednym cyklu litycznym trwającym około 15 minut dochodzi do uwolnienia średnio 200 potomnych (50–1000) cząstek wirusa. Każdy potomny wirus infekuje i zabija kolejne komórki bakteryjne, co powoduje, iż pod koniec drugiego cyklu pojawia się około 40000 potomnych cząstek, a pod koniec czwartego cyklu, czyli średnio po godzinie, już około 1,6 biliona.

   Odkrycie i wprowadzenie do lecznictwa bakteriofagów przypisuje się kilku naukowcom. Jako pierwszy na dziwne zjawisko pojawiania się przejaśnień w hodowli gronkowca na podłożu stałym zwrócił uwagę brytyjski lekarz Frederick Twort w 1915 roku. Postawił on hipotezę o istnieniu niewidocznego, pasożytniczego dla bakterii wirusa. W 1917 roku w Instytucie Pasteura francusko−kanadyjski mikrobiolog Felix d’Herelle zaobserwował takie samo zjawisko w przesączu kału ludzi chorych na czerwonkę, a wykryty czynnik przeciwbakteryjny nazwał Bacteriophagum intestinale. Naukowiec ten sukcesywnie zgłębiał naturę bakteriofagów oraz starał się je zastosować w leczeniu zakażeń bakteryjnych u ludzi i zwierząt. Jednak po raz pierwszy bakteriofagi zostały użyte w terapii nie przez d’Herelle’a, a przez prof. dr R. Bruynoghe’a i jego studenta J. Maisina w 1921 roku w leczeniu gronkowcowych zakażeń skóry.

 

 

 

 

   Terapia bakteriofagowa, chociaż nie była szeroko akceptowana w krajach zachodnich, była stosowana już na początku dwudziestego wieku a zwłaszcza w okresie II wojny światowej do leczenia czerwonki i gangreny u żołnierzy. W latach trzydziestych w Paryżu uruchomiono produkcję pięciu fagowych preparatów przeciwbakteryjnych Bacte-coli-phage, Bacte-intestini-phage, Bacte-pyo, Bacte-staphy-phage, Bacte-rhino-phage. W tych latach również firma Elli Lilly z Indianapolis produkowała co najmniej siedem preparatów fagowych skierowanych na gronkowce, paciorkowce i pałeczki okrężnicy używanych do leczenia ropni, ropiejących ran i infekcji dróg oddechowych. Jednak już w latach 1930–1934 pojawiały się doniesienia mówiące o istnieniu nieaktywnych preparatów bakteriofagów, śmiertelnych przypadkach wśród pacjentów poddanych takiej terapii oraz braku skuteczności leczenia z wyjątkiem terapii zakażeń wywołanych przez gronkowce. Prawdopodobną przyczyną takich przypadków była zarówno słaba znajomość natury fagów, jak również niedoskonałość metod odpowiedniego oczyszczania preparatów fagowych z białek bakteryjnych, w tym endotoksyn, których niewielka zawartość w preparacie mogła powodować zaostrzenie choroby, a nawet zgony pacjentów. Prymitywne metody oczyszczania lizatów przez dodawanie do nich związków rtęci, czynników utleniających oraz podgrzewanie mogły powodować inaktywację bakteriofagów, co skutkowało brakiem efektu terapeutycznego. W związku z notowaniem kontrowersyjnych wyników leczenia, a także faktu, że pojawiające się w latach czterdziestych antybiotyki okazały się wówczas skuteczniejsze, bezpieczniejsze i prostsze w użyciu, badania nad fagami w większości krajów zeszły na dalszy plan.

   Terapia fagowa była w tych czasach intensywnie praktykowana w Związku Radzieckim w wyniku współpracy zawiązanej przez Felixa d’Herelle z naukowcami z Instytutu Bakterifagów Eliava w stolicy Republiki Gruzińskiej, Tibilisi. Większość publikacji wydanych w ZSRR w latach trzydziestych i czterdziestych ubiegłego wieku wskazuje, że terapia ta stosowana była na szeroką skalę w leczeniu wielu bakteryjnych infekcji z dziedziny dermatologii (Beridze, 1938), okulistyki (Rodigina, 1938), urologii (Tsulukidze, 1938), stomatologii (Ruchko and Tretyak, 1936), pediatrii (Alexandrova i wsp., 1935; Lurie, 1938), otolaryngologii (Ermolieva, 1939) i chirurgii. Z powodzeniem terapię fagową stosowano w infekcjach wywoływanych przez bakterie z rodzaju Staphylococcus, Streptococcus, Klebsiella, Escherichia, Salmonella, Shigella i Pseudomonas. Skuteczność jej oceniano na 80-95% przypadków, opisując jednocześnie rzadkie, odwracalne skutki uboczne, w postaci zaburzeń żołądkowo-jelitowych. Niestety kryteria kliniczne prowadzonych terapii nie były odpowiednie i obecnie mogą budzić zastrzeżenia.

 

 

 

 

   Dzięki odkryciu i stosowaniu antybiotyków uratowano więcej istnień ludzkich, niż dzięki jakimkolwiek innym lekom w historii ludzkości. Po wielu sukcesach terapeutycznych, Główny Chirurg USA ogłosił pod koniec lat 60-tych XX wieku, że już pora zakończyć erę zakażeń bakteryjnych. Okazuje się jednak, że deklaracja ta została złożona przedwcześnie, bo właśnie od tamtych lat zaczęto notować coraz więcej dowodów na to, że antybiotyki stają się coraz mniej skuteczne. Poprzez nadmierne, nieracjonalne stosowanie tych substancji ratujących życie doprowadzono do wyselekcjonowania szczepów bakterii, które poprzez wypracowanie wielu różnych strategii działania (np. wytwarzanie enzymów hydrolizujących lub modyfikujących antybiotyki, uszczelnianie zewnętrznej błony komórkowej zabezpieczające przed wniknięciem antybiotyku do wnętrza komórki, mechanizmy aktywnego wypompowywania leku z komórki (efflux), zmiana w punkcie działania antybiotyku w komórce bakteryjnej) stały się niewrażliwe na stosowane antybiotyki. Natomiast łatwość przekazywania genów oporności, które często są zlokalizowane na ruchomych elementach genetycznych, plazmidach i transpozonach, sprawia, że komórki bakteryjne kompletują cały arsenał mechanizmów dający im cechy wielooporności (MDR – Multi Drug Resistance), ekstremalnej oporności (XDR – Extremly Drug Resistance) a nawet całkowitej oporności (PDR – Pan Drug Resistance), czyli niewrażliwości na wszystkie antybiotyki we wszystkich klasach aktywnych wobec danego gatunku drobnoustroju.

   Według danych Światowej Organizacji Zdrowia (WHO), każdego roku w Stanach Zjednoczonych umiera około 14000 osób z powodu zakażeń wywołanych przez wielooporne bakterie, a liczba ta z roku na rok się powiększa. Problemy związane z zakażeniami takimi bakteriami dotyczą również Polski. Fakt ten stanowi poważny problem medyczny, który nierozwiązany może doprowadzić do sytuacji z „ery przedantybiotykowej”, dlatego wiele organizacji międzynarodowych m.in. Światowa Organizacja Zdrowia, Komisja Europejska, amerykańska organizacja Food and Drug Administration (FDA) uznały tę sytuację za jedno z największych zagrożeń dla zdrowia publicznego. Z tego względu, zarówno walka z lekoopornością drobnoustrojów, jak również poszukiwania innych, bardziej efektywnych rozwiązań w zwalczaniu zakażeń bakteryjnych zostały uznane za działania priorytetowe. Jednak, jak wskazują dane, poszukiwania nowych leków przeciwbakteryjnych przez przemysł farmaceutyczny są ograniczone. Głównym powodem są ogromne koszty ponoszone w trakcie prowadzenia długoletnich badań naukowych, w tym przedklinicznych i klinicznych oraz nikła szansa na ich zwrot, wynikająca z wysokiego ryzyka związanego z możliwością stosunkowo szybkiej selekcji szczepów bakterii opornych na nowe związki. Taką sytuację obserwowano po paru latach od wprowadzenia do leczenia linezolidu i chinuprystyny/dalfoprystyny, kiedy to pojawiły się bakterie Gram-dodatnie oporne na te antybiotyki.

 

 

 

 

   Rozwój nauki sprawił, iż terapia bakteriofagowa stała się obecnie metodą obarczoną znacznie mniejszym ryzykiem powikłań w porównaniu z czasami d’Herelle’a. Dzięki rozwojowi technik laboratoryjnych możliwe jest otrzymywanie sterylnych, nietoksycznych dla człowieka lizatów zawierającymi aktywne bakteriobójczo bakteriofagi.

   Porównując terapię fagową z antybiotykoterapią należy zwrócić uwagę  na wiele zalet przypisywanych tej pierwszej. Bakteriofagi cechują się swoistością w stosunku do konkretnej zakażanej bakterii, zatem nie naruszają naturalnej, endogennej mikroflory bakteryjnej człowieka, co jest częstym skutkiem ubocznym stosowania antybiotyków, prowadzącym do nadkażeń bakteryjnych lub/i grzybiczych. Dowiedziono, że fagi mogą penetrować do słabo ukrwionych tkanek ciała, jak również pokonują barierę krew-mózg. Bakteriofagi działają w całkowicie odmienny sposób od wszystkich znanych mechanizmów działania dostępnych antybiotyków, dlatego są aktywne wobec bakterii posiadających nawet wiele różnych mechanizmów oporności. Niezwykle korzystną cechą bakteriofagów wykorzystywaną w terapii jest ich zdolność do wykładniczego wzrostu. W terapii teoretycznie może wystarczyć jedna dawka preparatu fagowego, ponieważ liczba cząstek fagowych zwiększa się po każdym cyklu replikacyjnym, zakażając coraz to nowe wrażliwe komórki bakteryjne. Replikacja trwa tak długo, jak długo w środowisku są obecne wrażliwe bakterie; gdy zmniejsza się liczba bakterii, liczba bakteriofaga również się obniża.

   Wysoka swoistość bakteriofagów w stosunku do określonych szczepów bakterii może być postrzegana jako wada. Skuteczność bakteriofagoterapii można uzyskać po wyizolowaniu czynnika etiologicznego odpowiedzialnego za zakażenie i określeniu jego wrażliwości na bakteriofagi, dzięki której wybrany zostanie efektywny fag lityczny dla konkretnego patogenu. Takie podejście uniemożliwia leczenie empiryczne, które ma istotne znaczenie w leczeniu nagłych, progresywnych zakażeń zagrażających życiu. Rozwiązaniem tego problemu mogą być złożone preparaty, zwane koktailami fagowymi, np. PhageBioderm oraz Intestiphage, powstałe w Instytucie Bakteriofagów w Tbilisi. PhageBioderm to nietoksyczny, podlegający biodegradacji kopolimer zawierający bakteriofagi, przeznaczony do pokrywania ran. Intestiphage jest mieszaniną 23 różnych fagów skierowanych przeciwko patogennym bakteriom przewodu pokarmowego. Mieszaniny takie pozwalają również rozwiązać problem mogącej się pojawić na drodze mutacji oporności bakterii na zakażenie bakteriofagiem. W odróżnieniu od oporności bakterii na antybiotyki, oporność na faga może zostać przezwyciężona dzięki zachodzącym zmianom mutacyjnym również w cząstkach fagowych. Dodatkowo, rozwój oporności bakterii na fagi wiąże się głównie z utratą ligandu, będącego nie tylko receptorem dla wirusa, ale pełniącego również wiele innych istotnych dla życia bakterii funkcji (tworzenie porów w bakteryjnej błonie zewnętrznej, wiązanie bakterii do powierzchni). Stwierdzono, że bakterie zyskujące oporność na fagi mogą jednocześnie tracić przez to swoje czynniki zjadliwości.

   Badania kliniczne dowiodły, że terapia fagowa może powodować niegroźne dla zdrowia i życia, odwracalne objawy uboczne, w przypadku których nie ma konieczności przerwania terapii. Opisywano występowanie przemijających dolegliwości gastrycznych, bólów głowy, mięśniowych i stawowych, w obrębie twarzy i jamy ustnej, uczucia osłabienia, rozbicia, wymiotów oraz zwyżek ciepłoty ciała. Po doustnym podaniu preparatu fagowego opisano występowanie objawów hepatalgii oraz wzrost temperatury ciała, a po podaniu miejscowym zanotowano nieliczne przypadki wystąpienia reakcji alergicznych. Wykazano, że terapia fagowa nie powoduje uchwytnych zaburzeń w organizmie, co potwierdzają wyniki badań laboratoryjnych wykonywane przed, w czasie i po przeprowadzonej terapii.

   Dystrybucja fagów w organizmie pacjenta nie jest jeszcze dokładnie poznana. Bakteriofagi podane doustnie penetrują do tkanki limfatycznej, a następnie do krwi, gromadzą się w nerkach i przedostają się do moczu. Okres, w którym można wyizolować fagi z krwi lub moczu gospodarza to tak zwany okres „bakteriofagemii”. W badaniach na zwierzętach po domięśniowym podaniu fagów stwierdzono ich obecność we wszystkich badanych tkankach, na przykład mięśniach, wątrobie, śledzionie, mózgu. Wydalanie fagów z organizmu odbywa się głównie przez nerki z moczem oraz z kałem.

   Od kilku lat obserwuje się olbrzymi wzrost zainteresowania użyciem fagów w profilaktyce i leczeniu zakażeń bakteryjnych, ponieważ istnieje nadzieja, że bakteriofagi mogą stanowić alternatywę dla kosztownych w opracowywaniu antybiotyków. Wiele prywatnych firm w USA, Kanadzie, Wielkiej Brytanii i Izraelu rozpoczęło intensywne badania w tej materii. Polska ma unikalną pozycję w świecie jeżeli chodzi o wkład w rozwój terapii fagowej. Badania i leczenie eksperymentalne jest prowadzone od wielu lat przez naukowców z Instytutu Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN im. Hirszfelda we Wrocławiu, a wyniki tych badań zostały zauważone, uznane i opublikowane w czasopismach naukowych światowej rangi. W 2005 roku został powołany do życia pierwszy w Unii Europejskiej Ośrodek Terapii Fagowej, w którym prowadzone jest leczenie eksperymentalne zakażeń wywołanych przez wielooporne szczepy bakterii, zgodne z aktualnymi wymogami formalnoprawnymi dotyczącymi terapii eksperymentalnej (między innymi zgoda komisji bioetycznej, świadoma zgoda pacjenta, ubezpieczenie). W kolekcji Instytutu zgromadzono około 300 terapeutycznych preparatów fagowych skierowanych przeciwko bakteriom z rodzaju Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Shigella, Serratia, Salmonella, Proteus, Pseudomonas, Acinetobacter, Burkholderia i Stenotrophomonas. Preparaty te stosowano z powodzeniem w leczeniu zakażeń skóry, kości i szpiku, przetok, ran, owrzodzeń podudzi, dróg moczowych, dróg rodnych, gruczołu krokowego, gruczołu piersiowego, przewodu pokarmowego, opon mózgowo-rdzeniowych, zatok i dolnych dróg oddechowych.

 

 

 

 

   Do Ośrodka Terapii Fagowej we Wrocławiu przyjmowani są pełnoletni pacjenci z przewlekłymi, objawowymi zakażeniami bakteryjnymi wywołanymi przez antybiotykooporne szczepy, którzy zgłaszają się samodzielnie lub są kierowani z placówki prowadzącej dotychczasowe leczenie. Preparaty fagowe są przygotowywane indywidualnie dla każdego pacjenta. Pierwszym etapem otrzymania skutecznego preparatu jest znalezienie w kolekcji faga wykazującego aktywność lityczną przeciwko szczepowi bakterii wyhodowanemu od pacjenta – proces ten nazywa się typowaniem fagowym. Jeśli uzyskany zostanie efekt lityczny dla badanego szczepu, w drugim etapie wyselekcjonowany rodzaj bakteriofagów namnaża się na szczepie wzorcowym lub szczepie wyhodowanym od pacjenta. Uzyskuje się w ten sposób tak zwany. lizat fagowy, w którym w wodzie peptonowej oprócz cząstek fagowych znajdują się produkty przemiany i rozkładu bakterii. Lizat przesącza się przez filtr bakteryjny, oznacza w nim miano fagów i ampułkuje (po 5 ml lub 10 ml). Gotowe preparaty poddaje się kontroli jałowości i przechowuje w temperaturze 2–8°C przez czas terapii. Preparaty podawane są pacjentom doustnie, doodbytniczo lub miejscowo przez kilka do kilkunastu tygodni.

   Publikowane dane z przeprowadzonych badań eksperymentalnych prowadzonych we współpracy z Instytutem Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN z Wrocławia na ponad 2000 pacjentach wskazują na wiele przypadków uzyskania poprawy stanu chorego oraz całkowitego wyleczenia infekcji bakteryjnej. Terapię fagową stosowano u pacjentów w wieku od 1 tygodnia do 89 lat z różnymi, spontanicznymi lub pooperacyjnymi ropnymi infekcjami. Pozytywne wyniki leczenia, oparte na ocenie skuteczności eliminacji procesu ropnego, gojeniu się zmian miejscowych i posiewach, uzyskano u ponad 90% pacjentów. W zależności od miejsca zakażenia i rodzaju infekującej bakterii uzyskanie sukcesu terapeutycznego zaobserwowano u 76-100% przypadków. Wykazano w jednym z badań, że całkowite wyleczenie (i całkowitą eliminację patogenu) uzyskano u 86% chorych, a poprawę stanu bez eradykacji bakterii u 10% pacjentów, natomiast u 4% chorych terapia była nieskuteczna. Przypuszcza się, że przyczyną niepowodzeń terapii fagowej może być wyselekcjonowanie fagoopornych szczepów bakterii, nadkażenie innymi bakteriami (w tym infekcje mieszane), niedocieranie fagów do komórek bakteryjnych w ognisku zakażenia lub występowanie u chorego przeciwciał neutralizujących fagi.

   Nieznane są odległe w czasie skutki stosowania terapii fagowej na organizm i materiał genetyczny człowieka. Dotychczas jednak nie pojawiły się doniesienia sugerujące możliwość wystąpienia jakichkolwiek komplikacji lub chorób u ludzi poddawanych tej terapii. Istniejące dane dowodzą wręcz, że terapia fagowa jest bezpieczną i skuteczną metodą leczenia chorych zakażonych wieloopornymi bakteriami i może być stosowana jako monoterapia lub w połączeniu z antybiotykoterapią. Należy również wspomnieć o nowym kierunku badań prowadzonych z wykorzystaniem enzymów litycznych bakteriofagów, które również dzięki swojej specyficzności i aktywności mogą się stać skutecznym lekiem przeciwko wieloopornym bakteriom powodującym trudne lub niemożliwe do wyleczenia infekcje.

   Można zadać pytanie, czy albo kiedy będziemy mogli kupować w aptece fagi lub ich enzymy lityczne na przykład w sprayu do stosowania na śluzówkę gardła, jako kompresy na zranienia i czyraki lub jako syropy na biegunki czy krople do oczu. Czy znowu zaczniemy te „leki” stosować bezpodstawnie i w nadmiarze oraz do jakich skutków po latach może takie postępowanie doprowadzić?
 

dr n. farm. Izabela Korona-Głowniak
Katedra i Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej
 z Pracownią Diagnostyki Mikrobiologicznej,
 Uniwersytet Medyczny w Lublinie

Fot. Fotolia.pl

Opracowano na podstawie:
1. Hanlon GW, Bacteriophages: an appraisal of their role in the treatment of bacterial infections. Int J Antimicrob Agents 2007, 30:118-128.
2. Miedzybrodzki R, Borysowski J, Fortuna W, Weber-Dąbrowska B, Górski A. Terapia fagowa jako alternatywa w leczniu zakażeń wywołanych przez bakterie antybiotykooporne. Kardiochirurgia i Toroakochirurgia Polska 2006; 3: 201-205.

3. Łysiak K. Bakteriofagi jako alternatywa dla antybiotyków – możliwość praktycznego ich zastosowania w chirurgii stomatologicznej – przegląd piśmiennictwa. Dent Med. Probl 2004, 41: 761-768.
4. Skurnik M, Strauch E. Phage therapy: Facts and fiction. Int J Med Microbiol 2006, 296: 5-14.