luty 2013, nr 78/56 online
1. Wstęp
Organizmy genetycznie modyfikowane (GMO) określa aktualna do dzisiaj definicja, zawarta w Ustawie o organizmach genetycznie modyfikowanych z dn. 22 czerwca 2001. Według ww. ustawy, jako GMO określa się organizm inny niż organizm człowieka, w którym materiał genetyczny został zmieniony w sposób nie zachodzący w warunkach naturalnych wskutek krzyżowania lub naturalnej rekombinacji.
Aż do początku lat 70-tych otrzymywanie organizmów GMO do wytwarzania substancji leczniczych, jak np. antybiotyki czy witaminy było indukowane za pomocą metod niespecyficznie modyfikujących określone geny, jak np. działanie promieniowania UV czy chemicznych czynników mutagennych, fuzja protoplastów bądź mikroiniekcje.
Otrzymano w ten sposób szereg linii produkcyjnych grzybów niższych i bakterii, o znacznie poprawionej produktywności, stosowanych np. do przemysłowego wytwarzania antybiotyków, aminokwasów, witamin czy dekstranu. Modyfikacje genetyczne ukierunkowane na określone geny rozpoczęły się od początku lat 70-tych XX wieku wraz z możliwościami praktycznego zastosowania odkryć dokonanych jeszcze w latach 50- i 60-tych, takich jak opis struktury DNA, sposób przekazu informacji genetycznej czy poznanie funkcji enzymów restrykcyjnych.
Od tego czasu stało się możliwe wprowadzanie określonych genów, dokładniej tzw. kodującego DNA (ang. coding DNA – cDNA), znajdującego się pod kontrolą odpowiednich, specyficznych dla danego organizmu sekwencji regulatorowych w postaci promotora i terminatora transkrypcji, czyli syntezy pierwotnego transkryptu RNA. W wektorze plazmidowym zawarte są też odpowiednie sekwencje regulujące proces biosyntezy białka (translacja) na matrycy mRNA. W ten sposób stała się możliwa nadekspresja enzymów o kluczowym znaczeniu dla szlaków biosyntezy np. antybiotyków, witamin czy aminokwasów. Jako sposób modyfikacji szlaku metabolicznego, mający na celu zwiększenie produktywności określonego produktu, wybierana jest na ogół zwiększona ekspresja enzymów kontrolujących szybkość szlaku biosyntezy lub dostarczających substratów do szlaku biosyntezy.
2. Otrzymywanie białek rekombinowanych o właściwościach leczniczych w GMO
2.1. Organizmy GMO stosowane do otrzymywania białek rekombinowanych o właściwościach leczniczych
Jako organizmy GMO do wytarzania substancji czynnych, stosuje się najczęściej określone szczepy bakterii (Escherichia coli), grzybów (Saccharomyces cerevisiae) i linie komórek zwierzęcych, jak np. CHO – Chinese Hamster Ovary i BHK- Baby Hamster Kidney. Zastosowania przemysłowe bakterii E. coli są ułatwione przez dokładną charakterystykę genetyczną poszczególnych szczepów, szybki przyrost biomasy spowodowany przez częste, zachodzące co 20-30 minut podziały komórkowe. Podłoża hodowlane dla wzrostu E. coli są stosunkowo tanie i proste. Istnieją też odpowiednie wektory w postaci kolistego, dwuniciowego DNA, stosowane w celu wprowadzania materiału genetycznego do E. coli. Zastosowanie odpowiednich, specyficznych dla bakterii sekwencji regulatorowych w promotorze i terminatorze wprowadzanego fragmentu cDNA, pozwala na wydajną transkrypcję i translację obcego cDNA. Powoduje to znaczne nagromadzenie białka rekombinowanego w cytoplazmie bakterii, dochodzące nawet do 20-25% białka całkowitego komórki.
Trudności związane ze stosowaniem tego systemu ekspresyjnego dotyczą ograniczeń w zakresie transportu białek rekombinowanych poza komórkę bakterii. Powoduje to na kolejnym etapie wydzielania i oczyszczania produktu (tzw. downstream processing), konieczność dokonania uszkodzeń ściany komórkowej i otoczki bakterii za pomocą np. wysokiego ciśnienia, detergentów, ultradźwięków, celem wyprowadzenia produktu na zewnątrz. Oddzielenie lipopolisacharydu o działaniu pirogennym i pozostałych białek komórki bakteryjnej wymaga stosowania wieloetapowej chromatografii jonowymiennej i filtarcji żelowej. Na przebieg procesu wydzielania i oczyszczania wpływają tzw. ciałka wtrącone (ang. inclusion bodies), czyli agregaty białka rekombinowanego, wytrącone w cytoplazmie komórki bakteryjnej, wskutek jego nadmiernej, niefizjologicznej koncentracji. Można je stosunkowo łatwo oddzielić przez wirowanie, jednak nierozpuszczalne złogi białka rekombinowanego zawarte w ciałkach wtrąconych w postaci zdenaturowanej, trzeba poddać renaturacji, przeprowadzając z powrotem w postać rozpuszczalną, co może wiązać się z przyjmowaniem nieprawidłowej struktury przestrzennej lub tworzeniem nieprawidłowych wiązań dwusiarczkowych. Skutkiem może być zmiana aktywności biologicznej białka rekombinowanego.
Problem braku glikozylacji w E. coli jest częściowo rozwiązany w S. cerevisiae, gdzie wprawdzie zachodzi glikozylacja, jednak sposób glikozylacji białek odmienny niż u organizmów wyższych, np. przyłączone jest znacznie więcej reszt mannozy. Takie białka są szybko wychwytywane z krwiobiegu i są szybciej degradowane, co powoduje krótszy okres półtrwania w osoczu. Problemem jest również nieco mniejsza zawartość białek rekombinowanych w komórce (do ok. 5%) i nieco mniejsza szybkość przyrostu biomasy hodowli S. cerevisiae, ponieważ podziały komórkowe zachodzą co około 3 godziny. Pomimo tego, niskie koszty mediów hodowlanych i dobrze opisane właściwości genetyczne powodują, że organizm ten jest nadal stosowany do wytwarzania białek rekombinowanych o zastosowaniach leczniczych.
Linie komórek zwierzęcych jak CHO i BHK wytwarzają białka rekombinowane, które są glikozylowane niemal dokładnie tak samo jak w komórkach ludzkich co w praktyce pozwala na otrzymanie związków o niemal identycznych właściwościach biologicznych. Trudności związane z tym rodzajem GMO wynikają z powolnego przyrostu biomasy, spowodowanego przez podziały komórkowe zachodzące co 24-36 godzin. Komórki zwierzęce wymagają złożonych podłoży hodowlanych i są wrażliwe na spotykane w bioreaktorach różnice stężeń tlenu, substancji odżywczych, jak np. glukozy czy naprężenia mechaniczne wywołane ruchem mieszadeł. W celu zmniejszenia wrażliwości komórek zwierzęcych na te niekorzystne warunki hodowlane w bioreaktorach, podlegają one dodatkowej modyfikacji genetycznej za pomocą genów zmniejszających skłonność do indukcji programowanej śmierci komórek (apoptozy) w niekorzystnych warunkach czy poprawiające transport glukozy do komórki.
2.2. Wybrane białka i peptydy rekombinowane wytwarzane przez GMO o zastosowaniach leczniczych
2.2.1. Rekombinowane hormony
Wytworzenie rekombinowanej insuliny człowieka pozwoliło na zastąpienie niedoskonałych pod względem leczniczym ekstraktów z trzustek wieprzowych, stosowanych od lat 30-tych XX wieku. Aktualnie światowa produkcja rekombinowanej insuliny ludzkiej wynosi ok. 6 ton rocznie, pozwalając na leczenie około 300 mln chorych na cukrzycę. Podstawowe informacje o preparatach rekombinowanej insuliny i innych hormonach stosowanych w lecznictwie zawiera tab. nr 1.
Tabela nr 1. Rekombinowane hormony – wybrane preparaty
Lp.
|
Nawa produktu
|
Właściwości
|
1
|
Humulin, Insuman
|
Identyczna z insuliną człowieka, produkowana w E. coli.
|
2
|
Novolin
|
Identyczna z insuliną człowieka, produkowana w S. cerevisiae.
|
3
|
Velosulin (Monotard, Insulatard, Ultrarad, Actrapid)
|
Identyczna z insuliną człowieka, produkowana w S. cerevisiae, formulacje o szybkim, pośrednim i powolnym działaniu.
|
4
|
Exubera
|
Identyczna z insuliną człowieka, produkowana w E. coli, podawana inhalacyjnie
|
5
|
Lantus (Glargine, Optisulin)
|
Asparagina w pozycji 21 łańcucha A zastąpiona przez glicynę, łańcuch B wydłużony o dwie reszty argininy, insulina długodziałająca, wytwarzana w E. coli.
|
6
|
Apidra (Glulisine)
|
Asparagina w pozycji 3 łańcucha B zastąpiona przez lizynę, lizyna w pozycji 29 łańcucha B zastąpiona przez kwas glutaminowy, wytwarzana w E. coli.
|
7
|
Levemir (Determir)
|
Usunięcie treoniny w pozycji 30 łańcucha B. Do reszty lizyny w pozycji 29 łańcucha B jest przyłączona kowalencyjnie reszta kwasu tłuszczowego C14.
|
8
|
Insulina Aspart
|
Zamiana proliny w pozycji 28 łańcucha B na kwas asparaginowy, zmniejszona zdolność do tworzenia dimerów i heksametrów, przyspieszone wchłanianie z tkanki podskórnej.
|
9
|
Insulina Lispro
|
Zamiana miejscami reszt proliny i lizyny, które znajdują się w pozycjach 28 i 29, łańcucha B, zmniejszona zdolność do tworzenia dimerów i heksametrów, przyspieszone wchłanianie z tkanki podskórnej.
|
10
|
GlucaGen
|
Rekombinowany glukagon, wytwarzany w S. cerevisiae. Leczenie hipoglikemii.
|
11
|
Hormon wzrostu
(Protropin, Humatrope, Nutropin, Norditropin, Nutropin AQ, Bio Tropin, Genotropin
|
Preparaty otrzymywane w E. coli, stosowane do leczenia niskorosłości u dzieci, niedoboru hormonu wzrostu u dorosłych, terapii zespołu Turnera.
|
12
|
Hormon wzrostu
(Saizen)
|
Preparat otrzymywany w komórkach zwierzęcych. Wskazania j.w.
|
13
|
Hormon wzrostu
(Scrostim)
|
Wyniszczenie towarzyszące AIDS.
|
14
|
Gonal F
|
Rekombinowana folitropina alfa, wytwarzana przez komórki CHO. Leczenie niepłodności.
|
15
|
Puregon/Follistim
|
Rekombinowana folitropina beta, wytwarzana przez komórki CHO. Leczenie niepłodności.
|
16
|
Luveris
|
Rekombinowana lutropina, wytwarzana przez S. cerevisiae. Leczenie niepłodności.
|
17
|
Erytropoetyna alfa (Binocrit, Eprex, Epogen)
|
Wytwarzane w komórkach CHO. Stosowana w leczeniu stanów niedokrwistości w przebiegu niewydolności nerek, nowotworów, po chemioterapii, przeszczepach szpiku, u pacjentów z AIDS.
|
18
|
Erytropoetyna beta (NeoRecormon)
|
Od formy alfa różni ją wyższy poziom glikozylacji (do 14 reszt kwasu sjalowego), co powoduje niższy klirens osoczowy i przedłużone działanie.
|
19
|
Darbepoetyna alfa (Aranesp)
|
Zawiera 22 reszty kwasu sjalowego – znacznie przedłużone działanie.
|
20
|
Epoetyna delta (Dynepo)
|
Wytwarzana w komórkach ludzkich, identyczna glikozylacja jak u człowieka.
|
21
|
Epoetyna zeta (Retacrit, Silapo)
|
Wersja „biopodobna” (ang. biosimilar), Epo alfa.
|
22
|
Epoetyna theta (Eporatio, Biopoin)
|
Wersja „biopodobna” (ang. biosimilar), Epo alfa.
|
23
|
Epoetyna omega (Epomax)
|
Wytwarzana przez komórki BHK a nie CHO.
|
2.2.2. Rekombinowane cytokiny i limfokiny o zastosowaniach leczniczych
W lecznictwie stosowane są preparaty Interleukiny 2 (IL-2) i 11 (IL-11). Rekombinowana IL-2 składa się ze 133 reszt aminokwasowych. Jest wytwarzana w E. coli i stanowi jeden z najsilniejszych czynników wzrostowych limfocytów T. IL-2 zwiększa cytotoksyczność limfocytów T wobec komórek nowotworowych. Dlatego preparaty IL-2 (Aldesleukina, Teceleukina, Proleukina), są stosowane w immunoterapii nowotworów (rak nerki, czerniak złośliwy). Lek podawany jest dożylnie lub w postaci immunoterapii adpoptywnej. Limfocyty T wyizolowane od pacjenta np. za pomocą leukoferezy czy wirowania w gradiencie limfoprepu, poddaje się inkubacji z IL-2 przez 5-10 dni. Limfocyty T przekształcają się wtedy w tzw. lymphokine activated killer cells (LAK), wprowadzane następnie ponownie do tego samego pacjenta.
Z kolei IL-11 (Neumega, Oprelvekin) jest wytwarzana jako białko rekombinowane przez E. coli, zwiększa proliferację megakariocytów i ich ploidię. Z tego powodu lek podawany jest osobom przed spodziewaną chemioterapią lub po jej przeprowadzeniu w celu zwiększenia ilości płytek krwi.
Nadmierne ilości interleukin, jak np. IL-1 wywierają działanie niekorzystne poprzez stymulowanie procesów zapalnych np. w przebiegu reumatoidalnego zapalenia stawów. W celu zahamowania szkodliwego działania nadmiernych ilości IL-1, podawany jest antagonista receptora IL-1 o nazwie Kineret (Anakinra), w postaci białka rekombinowanego, złożonego ze 153 reszt aminokwasowych, syntetyzowanego w E. coli.
Aktywność przeciwwirusową i przeciwnowotworową wykazują również interferony α, β, γ (IFN α, β, γ). Początkowo były one izolowane z leukocytów uzyskanych od dawców krwi. Następnie, począwszy od 1980 roku izolowano IFN-α (ogółem do 9 podtypów) wraz z niewielkimi ilościami IFN-β poprzez inkubację linii leukocytów i komórek limfoblastycznych np. Namalwa z wirusem Sendai i izolację powstających interferonów. Uzyskany preparat znany jest pod nazwą Wellferon. Ponieważ IFN-α nie są glikozylowane w organizmie człowieka, natomiast IFN-β i γ są wprawdzie glikozylowane, ale białka nieglikozylowane wytwarzane w E. coli nie różnią się istotnie aktywnością biologiczną od glikozylowanych, dlatego rekombinowane interferony są wytwarzane głównie w bakterii E. coli. W lecznictwie wykorzystuje się aktywność przeciwwirusową, głównie IFN-α i β oraz aktywność przeciwnowotworową IFN-γ, która wynika z indukcji powstawania komórek cytotoksycznych NK ze spoczynkowych limfocytów T. W lecznictwie wykorzystuje się szereg innych rekombinowanych cytokin. Podstawowe informacje o stosowanych preparatach interferonów i innych cytokin zawarto w
Tabela nr 2. Rekombinowane cytokiny i limfokiny – wybrane preparaty
Lp.
|
Preparat
|
System ekspresyjny
|
Wskazanie
|
1
|
Roferon A (rhIFN-α-2a), 24 Lys
|
E. coli
|
Przewlekłe wirusowe zapalenie wątroby (wzw) typu B, C i D.
Mięsak Kaposiego.
Białaczka włochato komórkowa.
Kłykciny kończyste; infekcja ludzkim wirusem papilloma (brodawczak).
|
2
|
PegIntron A/ViraferonPeg (PEGylated rIFN-α-2b)
|
3
|
Intron A/Viraferon (rIFN-α-2b), 24 Arg
|
4
|
Betaferon (rIFN-β-1b, brak Met 1, Cys 17 Ser
|
E. coli
|
Stwardnienie rozsiane.
|
5
|
Betaseron (rIFN-β-1b, brak Met 1, Cys 17 Ser
|
E. coli
|
Stwardnienie rozsiane.
|
6
|
Avonex (rhIFN-β-1a), Rebif (rhIFN-β-1a)
|
Komórki zwierzęce
|
Stwardnienie rozsiane.
|
7
|
Actimmune (rhIFN-γ-1b), Alfatronol/Virtron rhIFN-α-2a
|
E. coli
|
Leczenie przewlekłej choroby ziarniniakowej, wzw typu B i C.
|
8
|
Czynnik stymulujący kolonie granulocytarne (G-CSF.
Filgrastim, Neupogen, Lengrastim-Granocyte, Neulasta-Filgrastim modyfikowany przez PEG
|
E. coli, komórki CHO
|
Zwiększenie liczby granulocytów po chemio- lub radioterapii.
Leczenie niedokrwistości aplastycznych i zaburzeń procesu krwiotworzenia w przebiegu AIDS.
|
9
|
Czynnik wzrostu kolonii komórek granulocytarnych i makrofagowych GM-CSF
Molgramostim, Leucomax
|
E. coli,
S. cerevisae
|
Leczenie neutropenii wrodzonych i indukowanych przez chemio- lub radioterapię, powoduje przyspieszanie regeneracji szpiku po przeszczepach auto-lub allogenicznych. Leczenie niedokrwistości aplastycznych i zespołów mielodysplastycznych.
|
10
|
Czynnik wzrostu kolonii komórek makrofagowych M-CSF (CSF-1) Lanimostim
|
E. coli, komórki zwierzęce
|
Leczenie rozsianych zmian nowotworowych, stanów neutropenii, grzybic narządowych, głównie wywołane przez Aspergillus sp.
|
11
|
Czynnik Nekrozy Nowotworów TNF-α-1a (Beromun, Tasonermin),
|
E. coli
|
Leczenie mięsaków tkanek miękkich kończyn.
|
Z uwagi na objętość materiału, w niniejszym artykule nie zostały omówione rekombinowane szczepionki, czynniki krzepnięcia, tkankowe aktywatory plazminogenu, białka fuzyjne, przeciwciała monoklonalne oraz leki oparte na wektorach wirusowych, stosowane w terapii genowej nowotworów. Ich prezentacja może być przedmiotem osobnego opracowania.
dr Piotr Szymczyk
Adiunkt, p.o. Kierownika
Katedra Biologii i Biotechnologii Farmaceutycznej
Zakład Biotechnologii Farmaceutycznej
Uniwersytet Medyczny w Łodzi
Fot. Fotolia.com
Piśmiennictwo
1. A. Chmiel: Biotechnologia: podstawy mikrobiologiczne i biochemiczne. PWN Warszawa 1993, 1996, 1998.
2. O. Kayser, R.H. Muller (red.): Biotechnologia farmaceutyczna. PZWL, Warszawa 2003.
3. G. Walsh. Pharmaceutical Biotechnology, concepts and applications. John Wiley & Sons, 2007.
4. M. J. Groves. Pharmaceutical Biotechnology, second edition. Taylor & Francis Group, 2006.
5. N.S. Mosler, M.R. Ladisch. Modern biotechnology, connecting innovations in microbiology and biochemistry to engineering fundamentals. John Wiley & Sons, 2009.
6. A. Sadana. Bioseparation of proteins. Unfolding/folding and validation. Academic Press 1998..
7. S.Y. Lee, H.U. Kim, J.H. Park, J.M. Park, T.Y. Kim. Metabolic engineering of microorganinisms: general strategies and drug production. Drug Discovery Today, 2009, vol. 14, nr 1/2, str. 78-88.
8. J.H. Park, S.Y. Lee. Fermentative production of branched amino acids: a focus on metabolic engineering. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2010, vol. 85, str. 491-506.
9. A. Basu, X. Li, S. Su, J. Leong. Refolding of proteins from inclusion bodies. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2011, vol. 92, str. 241-251.
10. D. Porro, B. Gasser, T. Fossati, M. Maurer, P. Branduardi, M. Sauer, D. Mattanovich. Production of recombinant proteins and metabolites in yeasts. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2011, vol. 89, str. 939–948.
11. S. Sahdev, S.K. Khattar, K.S. Saini. Production of active eukaryotic proteins through bacterial expression systems: a review of the existing biotechnology strategies. Mol. Cell. Biochem. 2008, vol. 307, str. 249-264.
12. J. Y. Kim, Y. G. Kim, G. M. Lee. CHO cells in biotechnology for production of recombinant proteins: current state ant further potential. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2012, vol. 93, str. 917–930.
13. M. Nowicki, J.Z. Nowicka. Biofarmaceutyki oryginalne i leki biopodobne – co należy o nich wiedzieć, aby zapewnić bezpieczeństwo leczenia? Onkologia w praktyce klinicznej 2007, vol. 3 (3), str. 120-127.